GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的關(guān)系＊

劉寅強(qiáng)，楊百暉，夏健明，張學(xué)玉，張桂敏

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科，云南昆明 650032）

GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的關(guān)系＊

劉寅強(qiáng)，楊百暉，夏健明，張學(xué)玉，張桂敏

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科，云南昆明 650032）

目的探討γ谷氨酰羧化酶（GGCX）（rs6738645）基因型在中國漢族人群中的分布情況，以及其基因多態(tài)性與瓣膜置換術(shù)后華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性。方法采用Snapshot技術(shù)檢測228例研究對象GGCX（rs6738645）位點(diǎn)基因型，研究其基因型及等位基因頻率；比較其中176例瓣膜置換術(shù)患者基因多態(tài)性與華法林穩(wěn)定劑量的相關(guān)性。結(jié)果228例研究對象中，GGCX（rs6738645）位點(diǎn)基因型 TT、GT、GG 分別為84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T和 G等位基因的頻率分別為63.60%和36.40%；176例瓣膜置換術(shù)后患者服用華法林達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，華法林日維持劑量GG組低于TT、GT組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；基因型3組間國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）、凝血酶原時(shí)間（PT）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論中國漢族人群GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性可能是瓣膜置換術(shù)后華法林個(gè)體劑量差異的影響因素。

γ谷氨酰羧化酶；基因多態(tài)性；華法林；心臟瓣膜假體植入

華法林是目前使用最廣泛的口服抗凝藥，也是惟一被美國食品藥物管理總局（food and drug administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的瓣膜置換術(shù)后口服抗凝藥物［1］。在臨床應(yīng)用中，華法林治療適應(yīng)證較窄，個(gè)體用藥差異較大，近年的研究認(rèn)為，基因多態(tài)性是決定藥效的個(gè)體差異的主要原因［2－4］。國內(nèi)外研究表明，γ谷氨酰羧化酶（gamma-glutamyl carboxylation，GGCX）基因多態(tài)性與華法林劑量個(gè)體差異密切相關(guān)［5－6］，目前中國漢族人群的相關(guān)研究較少，為了解GGCX（rs6738645）基因型及等位基因在中國漢族人群中的分布情況及其基因多態(tài)性對華法林抗凝的影響。本研究應(yīng)用Snapshot技術(shù)對中國漢族人群的GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性情況進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取228例中國漢族人群作為研究對象，在取得知情同意書后抽血提取DNA，Snapshot法檢測基因多態(tài)性。其中52例為健康體檢者；176例為瓣膜置換術(shù)患者，為2010年1月至2012年3月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科行瓣膜置換術(shù)后服用華法林抗凝治療患者，其中男82例，女94例，年齡（44.44±12.33）歲，體質(zhì)量（59.19±11.03）kg，身高（1.64±0.71）cm。抗凝強(qiáng)度預(yù)設(shè)國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（international normalized ratio，INR）為1.5～2.5，隨訪3～24個(gè)月；瓣膜置換術(shù)患者術(shù)后均服用華法林抗凝超過2個(gè)月，兩次復(fù)查凝血檢查INR達(dá)到抗凝預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，無需調(diào)整劑量，視為達(dá)到抗凝穩(wěn)定狀態(tài)。記錄華法林日維持劑量，凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、INR等指標(biāo)，入選患者肝、腎功能指標(biāo)無異常，且未服用影響華法林療效指標(biāo)藥物。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與DNA提取 每例患者在華法林達(dá)到穩(wěn)定劑量時(shí)采集靜脈血5mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中作9∶1抗凝（標(biāo)本1.80mL，抗凝劑0.20mL），2mL用于測定PT、INR，剩余全血3 000r／min離心10min，棄上層血漿，分裝，沉淀細(xì)胞使用基因組試劑盒快速提取基因組DNA，－20℃保存。

1.2.2 基因分型 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含 GGCX（rs6738645）位點(diǎn)片段，引物由上海捷瑞公司合成。Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）為Fermentas公司產(chǎn)品，PCR儀型號為東勝龍（EDC-810）。多重PCR反應(yīng)體系含1.00μL模板 DNA，1.50μL 10×buffer緩沖液，1.50 μL MgCL2（25mmol），0.30μL dNTP，0.15μL 引物混合（20P），0.30μL Taq聚合酶，補(bǔ)水至15.00μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，60℃退火15s，－0.5℃（每循環(huán)降溫0.5℃）11個(gè)循環(huán)；72℃延伸30s，94℃變性15s，54℃退火15s，72℃延伸30s，72℃加長延伸3min，共24個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后取3μL PCR產(chǎn)物用于ExoⅠ和Sap純化，主要是去除反應(yīng)產(chǎn)物中的引物及dNTP。37℃保持45min，80℃保持15min，純化好后進(jìn)行延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物。延伸反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2.00μL，Snapshot Mix試劑1.00μL，延伸引物混合2.00μL，補(bǔ)水至6.00μL，96℃預(yù)變性1min，96℃變性10s，52℃退火5s30個(gè)循環(huán)。取1.00μL延伸產(chǎn)物，加8.00μL上樣緩沖液，95℃變性3min，立即冰水浴。測序儀型號為ABI 3730XL，研究隨機(jī)抽取10%樣本進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)。

圖1 GGCX（rs6738645）基因型的Snapshot峰型序列分析

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用χ2檢驗(yàn)判斷等位基因頻率和基因型頻率分布是否符合Hardy－Weinberg平衡。單因素方差分析基因多態(tài)性與穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)華法林抗凝指標(biāo)相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本基因型的判定 樣本的基因型通過Snapshot技術(shù)測序，各基因型的峰型測序結(jié)果，見圖1。

2.2 GGCX（rs6738645）等位基因和基因型分布頻率 228例研究對象中GGCX（rs6738645）位點(diǎn)基因型TT、GT、GG分別為84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T 和 G等位基因的頻率分別為63.60%和36.40%；預(yù)期基因型TT、GT和 GG 分 別 有92例（40.35%）、106例（46.49%）、30例（13.16%），經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，所選隨機(jī)人群 GGCX（rs6738645）等位基因頻率和基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.592，P＝0.501）。

表1 基因多態(tài)性與穩(wěn)定狀態(tài)華法林抗凝的相關(guān)性（±s，n＝176）

表1 基因多態(tài)性與穩(wěn)定狀態(tài)華法林抗凝的相關(guān)性（±s，n＝176）

基因型 n INR PT 華法林（mg／d）TT 62 1.85±0.27 21.26±2.16 3.13±0.87 GT 96 1.88±0.20 21.65±1.70 3.20±0.95 GG 18 1.93±0.27 21.97±2.30 1.85±0.73 F 0.420 0.611 8.805 P 0.658 0.545 0.000

2.3 GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性對華法林抗凝的影響176瓣膜置換術(shù)患者，基因型TT、GT、GG分別為62例，96例，18例，當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定抗凝狀態(tài)時(shí)，GGCX（rs6738645）基因型3組INR、PT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；華法林日維持劑量GG型低于TT、GT型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

3 討 論

人工機(jī)械瓣膜置換術(shù)后患者需要終身服用華法林抗凝治療，但華法林治療適應(yīng)證較窄，個(gè)體用藥差異大，容易導(dǎo)致出血、栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥。近年來，國內(nèi)外研究表明，基因多態(tài)性與華法林劑量有重要相關(guān)性［7－10］。GGCX是維生素K循環(huán)中的關(guān)鍵酶，其作用是將無活性的維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的前體羧化后成為有活性的凝血因子，近年的研究表明，GGCX是影響抗凝藥華法林劑量個(gè)體差異的遺傳因素之一［11－12］，其中研究較多的是 G3261A（rs12714145）位點(diǎn)多態(tài)性與華法林劑量個(gè)體差異的相關(guān)性，但對于GGCX（rs6738645）位點(diǎn)多態(tài)性的研究，國內(nèi)少有相關(guān)報(bào)道。

本研究中，采用了Snapshot技術(shù)，對中國漢族人群GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，228例中國漢族人群GGCX（rs6738645）位點(diǎn)的基因型TT、GT、GG分別為84例（36.84%）、122例（53.51%）、22例（9.65%），T 和 G等位基因的頻率分別為63.60%和36.40%；預(yù)期基因型TT、GT和 GG 分別為92例 （40.35%）、106例 （46.49%）、30 例（13.16%），經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析，所選人群 GGCX（rs6738645）等位基因頻率和基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.592，P＝0.501）。其中少數(shù)等位基因 G的頻率為36.40%。臺灣人群研究顯示，少數(shù)等位基因頻率為39.25%［13］；Wadelius等［14］對歐洲人群研究顯示，少數(shù)等位基因頻率為30%，與本研究結(jié)果基本一致。本研究對176例瓣膜置換術(shù)后華法林抗凝治療的患者進(jìn)行基因多態(tài)性測序，176瓣膜置換術(shù)患者，基因型TT、GT、GG分別為62例，96例，18例，當(dāng)達(dá)到穩(wěn)定抗凝狀態(tài)時(shí)，GGCX（rs6738645）基因型3組INR、PT比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；華法林日維持劑量比較，GG型低于TT、GT型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。臺灣人群研究顯示，華法林日維持劑量與基因多態(tài)性無顯著相關(guān)性（P＝0.914）［13］；對歐洲人群研究顯示，華法林日維持劑量與 GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）［6.14－16］，研究結(jié)果在不同人群間存在差異，可能與不同人種間基因多態(tài)性差異相關(guān)。

綜上所述，本文初步得出中國漢族人群GGCX（rs6738645）基因型及等位基因分布頻率，并且證實(shí)其基因多態(tài)性與華法林劑量有顯著相關(guān)性，其基因多態(tài)性可能是華法林劑量個(gè)體性差異的影響因素，但本研究樣本例數(shù)較少，需要進(jìn)一步明確GGCX（rs6738645）基因多態(tài)性與華法林抗凝的相關(guān)情況，尚需今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

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Research on correlation between GGCX（rs6738645）polymorphism and warfarin stable dose＊

LiuYinqiang，YangBaihui，XiaJianming，ZhangXueyu，ZhangGuimin
（DepartmentofCardiovascularSurgery，F(xiàn)irstAffiliatedHospital，KunmingMedicalUniversity，Kunming，Yunnan650032，China）

ObjectiveTo investigate the gamma glutamine carboxylase（GGCX，rs6738645）genotype distribution in Chinese Han population and the correlation between GGCX（rs6738645）polymorphism and the warfarin stable dose in the patient after valve replacement.MethodsThe genotypes of 228cases were detected by the Snapshot technology in order to explore the genotype and allele frequencies.The correlation between the gene polymorphism in 176cases after valve replacement and the stable dose of warfarin was compared.ResultsIn total of 228research subjects，the number of TT，GT and GG genotype were 84（36.84%），122（53.51%）and 22（9.65%）.The frequencies of T and G allele were 63.60%and 36.40%respectively；in 176patients after the valve replacement，the maintenance stable dose of warfarin was lower in GG group than in the TT and GT groups，the differences between the groups showed statistical significance（P＜0.01）.The PT value and INR value had no statistical difference among 3 genotype groups（P＞0.05）.ConclusionThe GGCX（rs6738645）polymorphism in Chinese Han population may be the influencing factor of warfarin individual dose difference in the patients after valve replacement.

gamma-glutamyl carboxylation；gene polymorphism；warfarin；heart valve prosthesis implantation

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.010

A

1671-8348（2014）10-1184-03

云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011CI137）。

劉寅強(qiáng)（1980－），主治醫(yī)師，在讀博士研究生，主要從事心血管外科疾病分子生物學(xué)研究。

2013-09-20

2013-12-24）

論著·臨床研究