骨組織工程中臍帶間充質(zhì)干細胞的應用進展

蘇召維 王永東 劉 聰

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學外科學，內(nèi)蒙古呼和浩特 010058

骨組織工程中臍帶間充質(zhì)干細胞的應用進展

蘇召維 王永東 劉 聰

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學外科學，內(nèi)蒙古呼和浩特 010058

MSCs是具多向分化與自我復制能力的干細胞，能夠分化成為多種類型的組織細胞。相比于骨髓間充質(zhì)干細胞與脂肪間充質(zhì)干細胞，MSCs成本較低、來源充足、對捐獻者不構(gòu)成病毒或細菌感染，在未來的臨床應用中展現(xiàn)了較好的發(fā)展與應用潛力。該文對骨組織工程中臍帶間充質(zhì)干細胞的應用進展進行分析。

骨組織工程;臍帶;間充質(zhì)干細胞

骨折及骨科疾病是臨床中較為常見的病癥，為患者帶來了一定身體痛苦與經(jīng)濟負擔。目前臨床中針對骨折與骨科疾病的治療，主要采用自體移植、人工植入及異體移植等，但上述方式均存在一定缺陷。MSCs具強大的多向分化功能，能夠誘導分化成骨細胞，幫助提升骨折或骨科疾病的治療效果。在此背景下，對骨組織工程中臍帶間充質(zhì)干細胞的應用進展進行分析具一定現(xiàn)實意義。

1 MSCs的分離與培養(yǎng)

1.1 MSCs的分離

吉林大學生物醫(yī)學工程學院的楊晨[1]對MSCs的分離進行了研究，首先在手術(shù)室收集得到足月分娩的、健康的、新鮮的胎兒臍帶，將其放于融入了濃度為0.1%雙抗的氯化鈉溶液中，在實驗室內(nèi)對臍帶進行間充質(zhì)干細胞分離。其次，將臍帶取出，浸泡于酒精內(nèi)約5 min，后以碘酒進行充分擦拭消毒，置于氯化鈉溶液下反復清洗，直至外圍血塊完全沖掉。將臍帶剪至2 cm/段的大小，以鑷子固定住臍帶邊緣，用剪刀小心剔除臍帶外膜，將內(nèi)含的華氏膠組織分離出來。取膠完成后接著剔除臍帶內(nèi)的血管，再次以氯化鈉溶液沖洗，或直接在融入了濃度為0.1%雙抗的氯化鈉溶液中進行，以保證操作的無菌性。

1.2 MSCs的培養(yǎng)

武漢大學中南醫(yī)院的胡培[2]等人對MSCs的分離、培養(yǎng)進行了研究，其MSCs分離操作與楊晨基本相同，華氏膠組織成功分離后，將其放入α-MEM培養(yǎng)液（內(nèi)涵100 U/mL鏈霉素與青霉素、10%胎牛血清）中，在CO2濃度為5%、箱內(nèi)溫度為37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長情況，以0.25%胰蛋白酶進行傳代培養(yǎng)。北京協(xié)和醫(yī)學院的李鐸[3]選擇將切成管狀的臍帶繼續(xù)切片，再將片狀臍帶組織切割致2～3 mm3，利用吸管逐一將碎狀臍帶組織植入T75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶已預先由D/F12培養(yǎng)基（內(nèi)含有濃度為20%的FBS）包被完成，植入密度為每瓶20～25塊碎狀臍帶組織；再將培養(yǎng)瓶置于溫度為37℃，CO2濃度為5%的溫箱中，定時向箱內(nèi)補充培養(yǎng)基（1 mL/d），每隔3 d全量換液。

哈爾濱第五醫(yī)院手外科分院的聶廣辰[4]等人對臍帶間充質(zhì)干細胞生長曲線的繪制進行了研究，在細胞傳代培養(yǎng)至第3代時將其分別種植于6孔板的其中4孔中持續(xù)培養(yǎng)8 d，按MTT法對細胞的增值情況進行測定，當細胞增值密度飽和，細胞進入平頂期時停測。卓峰等人[5]在細胞增殖特定于曲線繪制的研究中提出，現(xiàn)階段培養(yǎng)MSCs普遍采用的方法包括酶消化法與培養(yǎng)法，對MSCs細胞進行初代培養(yǎng)，該過程消耗約2 w，當細胞融合率致80%時開始傳代培養(yǎng)，在細胞種植2～4 d時增殖趨勢最盛，傳至第15代時增殖速度開始減慢，至20代時增殖基本結(jié)束。早期的細胞增殖的潛伏期在植入后的36 h內(nèi)，之后開始了成對增長（5～6 d），增殖密度達到飽和后進入到平頂期，綜上可知細胞增殖曲線呈“S”型。

2 MSCs的特征

2.1 細胞形態(tài)與生長特征

第二軍醫(yī)大學的胡凱猛[6]在顯微鏡下對MSCs的形態(tài)進行觀察，按貼塊法獲取初代細胞后對其進行種植，4～5 d后即可在貼塊下方觀察到沿瓶底生長的hUMSCs，種植7 d后能夠觀察到細胞數(shù)量不斷增多，主要呈小梭形及小三角形，繼續(xù)培養(yǎng)細胞漸成集落狀生長，且生長狀態(tài)較為均衡，邊界清晰，伴有生長暈。酶消化法培養(yǎng)下初代細胞生長速度較培養(yǎng)法快，通常2～3 d后即在瓶底出現(xiàn)細胞，7 d后由小梭形及小三角形變?yōu)槎嘟切?、紡錘形，且生長迅速，集落生長呈緊靠型。14～15 d后達到約85%的融合。MSCs胞漿較少，小梭形的形態(tài)較為顯著，細胞核周的顆粒物質(zhì)較少，消化傳代完成后細胞解除集落樣生長，且分布均勻。

2.2 細胞免疫學特征

呂鵬飛等人[7]在關(guān)于細胞免疫學特征的研究中提出，MSCs的免疫學優(yōu)勢顯著，主要表現(xiàn)在其可以脫離免疫抑制作用而沖破MHC屏障，將細胞植入遠交動物體內(nèi)。在UCMSC的免疫學特征分析中，證實其對人外周血單核細胞、鼠脾細胞及純化T細胞等免疫細胞具有抑制作用，從而減緩其增殖速度。毛希宏[8]的相關(guān)研究證明MSCs表面的抗原存在非專一性，主要包括細胞因子與生長因子受體類、粘附分子類、整和素家族成員類與其他分子類等四大類，實驗結(jié)果表明UCMSCs中，CD29、CD73、CD44、CD13、CD105的陽性率超過90%，而CD134、CD45、CD11b則為陰性，在23代內(nèi)的傳代培養(yǎng)中，各類細胞因子無明顯差異，證明UCMSCs在經(jīng)過多代培養(yǎng)之后免疫學性質(zhì)較為穩(wěn)定。

2.3 細胞的誘導分化特征

hUCMSC的誘導分化能力較強，能夠?qū)崿F(xiàn)多向分化，包括內(nèi)胚層、中胚層與外胚層。在張亞斌等人[9]的細胞誘導分化體內(nèi)研究中，證實hUCMSC能夠分化成為內(nèi)皮細胞、心肌細胞、骨骼細胞、多巴胺能神經(jīng)元細胞、神經(jīng)細胞等，而在細胞誘導分化體外研究中，還發(fā)現(xiàn)hUCMSC可分化為成骨細胞、肝細胞、脂肪細胞、胰島樣細胞、生殖細胞、平滑肌細胞等，在研究hUCMSC分化成為成骨細胞時，發(fā)現(xiàn)在誘導過程中hUCMSC的ALP活性提升，且鈣結(jié)節(jié)與鈣沉積現(xiàn)象明顯，證明其具成骨細胞的誘導潛能。上述研究結(jié)果表明，hUCMSC誘導分化功能強大，在臨床中的應用價值與應用范圍明顯優(yōu)于造血干細胞。

3 討論

骨組織工程是近年來臨床新興的學科，其中胚胎干細胞作為骨組織工程研究的熱點與重點，受到了臨床醫(yī)學界的廣泛關(guān)注。通過上述研究可知，MSCs分化潛能較高，在軟骨、成骨、韌帶、肌腱、肌肉、神經(jīng)、心肌、肝等組織中均具誘導分化潛能，臨床應用前景廣闊。李素萍等人[10]相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在標準的細胞培養(yǎng)環(huán)境下，MSCs能夠沿培養(yǎng)瓶進行增值，可以表達CD44、CD105及CD90，但不能表達HLA-DR、CD34及CD45，在體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出成骨細胞的誘導分化潛能。

在此背景下通過改進現(xiàn)有MSCs誘導分化為成骨或軟成骨細胞的培養(yǎng)方式，或在已知干細胞的基礎上找尋新型干細胞，以提升胚胎細胞在骨組織工程研究中的合適度，成為目前國內(nèi)外相關(guān)研究的探索目標。在現(xiàn)代生物科技快速發(fā)展的時代背景下，學者們一定可以尋找到理想的培養(yǎng)途徑或干細胞類型，不斷推動骨組織工程的發(fā)展前進。

[1]楊晨.臍帶間充質(zhì)干細胞的分離鑒定[D].長春：吉林大學,2013:9-11.

[2]胡培.人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].生物技術(shù)通訊,2014,25 (1):87-90.

[3]李鐸.人臍帶間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)方法的研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學院,2011:14-22.

[4]聶廣辰.人臍帶間充質(zhì)干細胞生物學特性及向成骨細胞分化的研究[J].中國傷殘醫(yī)學,2014,22(6):48-52.

[5]卓鋒.人臍帶間充質(zhì)干細胞應用研究進展[J].中國矯形外科雜志,2012,20 (1):49-51.

[6]胡凱猛.人臍帶間充質(zhì)干細胞向造血細胞方向分化的研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學,2012:21-23.

[7]呂鵬飛,張光武.臍帶間充質(zhì)干細胞在骨組織工程中的研究進展[J].中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2013,7(10):4433-4435.

[8]毛希宏.人臍帶間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)鑒定及其向神經(jīng)元細胞分化的研究[J].昆明醫(yī)學院學報,2011,32(1):41-47.

[9]張亞斌,解莉楠.人臍帶間充質(zhì)干細胞研究進展及應用前景[J].生物技術(shù)通訊,2013,24(3):437-438.

[10]李素萍.人臍帶間充質(zhì)干細胞低溫凍存后生物學鑒定[J].臨床輸血與檢驗,2012,14(4):289-294.

The Application of Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering

SU ZhaoweiWANG Yongdong LIU Cong
Inner Mongolia medical university,Hohhot,Inner Mongolia，010058，China

MSCs is multi-directional differentiation and replicate ability of stem cells,It can differentiate into multiple types of cells.Compared with bone marrow mesenchymal stem cells and adipose mesenchymal stem cells,The source of MSCs was sufficient and cost was low,and it does not infect to the donor,It's clinical application shows the good development and potential applications in future.In this paper,The application were reviewed on Umbilical cord mesenchymal stem cells in bone tissue engineering.

Bone tissue engineering;The umbilical cord;Mesenchymal stem cells

R329

A

1674-0742（2014）10（c）－0195-02

2014-08-16)

蘇召維（1972.11-），男，內(nèi)蒙呼和浩特人，碩士在讀，研究方向：主治醫(yī)師，骨科急診醫(yī)學。