γ-分泌酶在阿爾茨海默病發(fā)病中的作用及與神經(jīng)型尼古丁受體關(guān)系

任家謀 齊曉嵐 官志忠

(貴陽醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(AD)是一種最常見的人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變，臨床上將其定義為進(jìn)行性認(rèn)知功能的喪失和從中年期到晚年期緩慢發(fā)生的進(jìn)行性記憶損傷〔1〕。病理學(xué)上以細(xì)胞外老年斑(SPs)形成及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)為主要特征〔2〕，還伴有顆?？张葑冃?GD)、平野小體(HB)、神經(jīng)元減少等〔3〕。本文就AD的發(fā)病機(jī)制及研究現(xiàn)狀、γ-分泌酶在AD發(fā)病中的作用、神經(jīng)型尼古丁受體與γ-分泌酶的關(guān)系及神經(jīng)型尼古丁受體在其中的作用做如下綜述。

1 AD的發(fā)病機(jī)制及研究現(xiàn)狀

在歐美發(fā)達(dá)國家及我國，AD發(fā)病有增多的趨勢。一般在65歲左右時(shí)，AD的發(fā)病率約為2%～5%，年齡75歲左右時(shí)，發(fā)病率約為10%，年齡到90歲時(shí)，AD發(fā)病率可高達(dá)35%～40%〔4〕。目前認(rèn)為AD是由遺傳學(xué)因素、環(huán)境因素和代謝因素等多種因素共同作用所引起的一種病理過程，涉及多種機(jī)制。

1.1β-淀粉樣蛋白(Aβ)的異常沉積 AD的特征性病理標(biāo)志之一是SPs形成。SPs主要是Aβ包括Aβ40和Aβ42沉積的結(jié)果〔5〕。因此腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生、聚集和沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病機(jī)制的首要和中心環(huán)節(jié)。Aβ由淀粉樣蛋白前體 (APP) 經(jīng)過β和γ-分泌酶連續(xù)的蛋白酶裂解產(chǎn)生。γ分泌酶組分早老素(PS)包括PS-1和PS-2突變導(dǎo)致APP水平增加或APP裂解改變使Aβ超量產(chǎn)生是引起家族性早發(fā)AD的主要原因〔6〕。

1.2Tau蛋白異常磷酸化 Tau蛋白的高度磷酸化在促進(jìn)AD患者神經(jīng)細(xì)胞退行性變中起著關(guān)鍵作用〔7〕。Tau蛋白是一種含磷的蛋白質(zhì)，正常成人Tau蛋白中磷酸含量為2～3 mol/g，而在 AD 患者中，Tau白蛋被異常過度磷酸化從而使Tau蛋白的磷酸含量增高至5～12 mol/g〔8〕，是正常含量的3～4倍。高度磷酸化的Tau蛋白可抑制微管蛋白的裝配和降低神經(jīng)元的運(yùn)輸效率，在AD的發(fā)生機(jī)制中有重要的作用〔9〕。

1.3膽堿能功能降低 乙酰膽堿(ACh)為促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)遞質(zhì)。AD患者腦組織中膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，膽堿能受體密度降低，膽堿能活性與SPs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)〔10〕。臨床上用抗酯解酶藥物降低膽堿酯酶的活性的活性來提高ACh的水平，可改善AD患者記憶力降低和定向障礙等癥狀〔11〕。DeKosky等〔12〕通過對輕度認(rèn)知障礙(MCI)輕、中度AD患者和正常人腦內(nèi)多個(gè)區(qū)域ChAT活性測定發(fā)現(xiàn)，MCI和AD患者ChAT水平與正常人無明顯差異，僅在AD晚期ChAT水平降低。

1.4自由基學(xué)說 研究表明，AD患者大腦中自由基水平上升，包括超氧化物陰離子自由基、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物和自由羰基等含量增加〔13〕。體外研究指出，活性氧促進(jìn)Aβ的毒性和聚集，而Aβ也是自由基生成增多〔14〕。體內(nèi)研究也表明，Aβ的沉積誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生，Aβ的神經(jīng)毒性作用很大程度上由自由基所介導(dǎo)，而自由基增多又極大地促進(jìn)了Aβ的沉積，造成一種神經(jīng)細(xì)胞受損和功能紊亂的惡性循環(huán)狀態(tài)〔15〕。

1.5生物膜性脂質(zhì)和膽固醇代謝的改變 有研究結(jié)果指出AD患者腦組織神經(jīng)膜中的神經(jīng)節(jié)苷脂含量明顯減少，其減少程度與神經(jīng)元的喪失和神經(jīng)元面積縮小有關(guān)〔16〕。近年研究表明，高膽固醇可增強(qiáng)APP代謝過程中β分泌酶的活性，使APP產(chǎn)生Aβ增多，降低膽固醇水平可使α分泌酶活性增強(qiáng)從而減少Aβ的生成〔17〕。既往的研究也表明使用降膽固醇合成藥-司汀類藥(statins)可上調(diào)細(xì)胞中α7尼古丁受體并具有神經(jīng)保護(hù)作用〔18〕。因此，生物膜脂質(zhì)的異常改變和膽固醇代謝改變與神經(jīng)元的形態(tài)功能變化以及神經(jīng)元的死亡有關(guān)，是AD發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中不可忽視的重要因素之一。

2 γ-分泌酶在AD發(fā)病中的作用

引起AD發(fā)病密切相關(guān)的酶即 Aβ的代謝需要三種關(guān)鍵酶： α，β，γ-分泌酶。APP由α分泌酶Aβ區(qū)域內(nèi)部Lys16-Leu17之間的肽鍵，產(chǎn)生分泌型的APP(sAPPβ)和C83片段，而C83片段又在γ-分泌酶的作用下產(chǎn)生較小的具有神經(jīng)毒性作用的P3和胞內(nèi)片段AICD，此為非淀粉樣肽源性途徑。而淀粉樣肽源性途徑則是由β-分泌酶裂解APP分子β部位的第一個(gè)氨基酸之前的肽鍵產(chǎn)生sAPPα和C99片段，再由γ-分泌酶切開C99片段中39～44之間的肽鍵，產(chǎn)生不溶性的完整的Aβ1～42/43，含有39～43個(gè)氨基酸。γ-分泌酶是產(chǎn)生Aβ的最后一步，對調(diào)節(jié)產(chǎn)生Aβ40 和Aβ1～42起著關(guān)鍵的作用〔19〕。Farfara等〔20〕首次證明γ-分泌酶在AD中具有雙重作用。一種作用是裂解APP產(chǎn)生Aβ，另一種是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞以清除Aβ的積聚及其神經(jīng)毒性。研究表明，PS是γ-分泌酶亞族的催化劑，PS1與PS2能夠減少小膠質(zhì)細(xì)胞活性，二者和γ-分泌酶抑制劑一樣能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)，蛋白水平和遷移能力，這些變化也會(huì)降低可溶性Aβ的吞噬作用。所以目前該酶被認(rèn)為是開發(fā)AD藥物的重要靶點(diǎn)。

γ-分泌酶分子量約為200～250 kD，酶切位點(diǎn)位于低位的跨膜片段中間，生物化學(xué)研究表明γ-分泌酶復(fù)合體由早老蛋白(PS)，單過性跨膜蛋白(NCT)，整跨膜蛋白APH-1和PEN-2四部分組成〔21〕。

廣泛表達(dá)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體腔隙的PS是γ-分泌酶活性所必需的，包括同源性為67%的兩種同源異構(gòu)體PS1和PS2。含有γ-分泌酶活性的催化位點(diǎn)的PS-1是由467個(gè)氨基酸組成的約為50 kD的整膜蛋白，由8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域(TM)和一個(gè)大的親水性環(huán)構(gòu)成。TM6和TM7中各有一個(gè)保守的天冬氨酸。PS-1在TM6和TM7之間的細(xì)胞溶質(zhì)環(huán)內(nèi)水解形成相互關(guān)聯(lián)的兩部分：28 kD的N-端片段(NTF)和18KD的C-端片段(CTF)。每一部分貢獻(xiàn)一個(gè)Asp活性位點(diǎn)形成γ-分泌酶活性中心。PS全蛋白(PS)是無活性的前體，水解后的NTF和CTF形成PS異二聚體具有活性，這與該酶的酶切位點(diǎn)位于APP的跨膜區(qū)是一致的〔21〕。

提高PS的表達(dá)并不能提高γ-分泌酶活性，因?yàn)镻S含量的變化受到多種因素的影響例如Notch的反饋調(diào)節(jié)，所以在研究γ-分泌酶活性過程中單純地測定PS的表達(dá)量并不能代表酶活性的變化〔22〕。Esler等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)PS的異二聚體和NCT都特異性地結(jié)合γ-分泌酶抑制劑并且和γ-分泌酶活性有關(guān)，表明NCT也是影響γ-分泌酶的活性因素。抑制NCT的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致減少PS的CTF的形成和APH-1和PEN-2的表達(dá)，增加APP的C端片段，減少Aβ的生成。

跨越7個(gè)跨膜區(qū)的整膜蛋白APH-1，分子量約為30 kD。研究表明，過分表達(dá)的APH-1和NCT能形成穩(wěn)定的而無活性的γ-分泌酶高分子復(fù)合體。通過對APH-1的氨基酸序列對比，發(fā)現(xiàn)APH-1在TM4中含有一個(gè)保守的氨基酸序列，用Asp取代首位的Gly將會(huì)使APH-1產(chǎn)生失去功能的突變，影響-分泌酶復(fù)合體的活性，表明TM4中小的疏水結(jié)構(gòu)的Gly促進(jìn)生成活性γ-分泌酶復(fù)合體〔24〕。

PEN-2是一個(gè)有101個(gè)氨基酸組成的發(fā)夾樣的整膜蛋白，分子量約為12 kD，有兩個(gè)疏水的跨膜區(qū)，在切割各種Ⅰ型跨膜蛋白有重要的作用。PEN-2的N端和C端與γ-分泌酶復(fù)合體的各組成部分在內(nèi)腔相互作用，包括NCT的外功能區(qū)，PS和APH-1的細(xì)胞外環(huán)。PEN-2的C端與PS相互作用，促進(jìn)NCT成熟和PS的內(nèi)切蛋白酶解，促進(jìn)Aβ分泌〔25〕。

龍志敏〔26〕取成年癡呆小鼠的腦組織進(jìn)行r免癥熒光雙標(biāo)，結(jié)果顯示：癡呆小鼠腦部各區(qū)均出現(xiàn)大量的Nct陽性細(xì)胞(綠色熒光)和Aβ陽性細(xì)胞(紅色熒光)，但在大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)NCT陽性神經(jīng)元的數(shù)量要多于Aβ陽性細(xì)胞，且在一些神經(jīng)元內(nèi)NCT與Aβ出現(xiàn)共存。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：PS1在成年雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠腦組織的分布趨勢同NCT高度一致。不同的是，在神經(jīng)元內(nèi)PS1免疫陽性物在胞質(zhì)表達(dá)較強(qiáng)，而NCT免疫陽性物在胞漿、胞膜均有強(qiáng)表達(dá)。

3 神經(jīng)型尼古丁受體在AD中的作用及與γ-分泌酶的關(guān)系

神經(jīng)型尼古丁受體(nAChR)與很多大腦功能有關(guān)，在AD的發(fā)病中占有重要的作用。通過對AD患者的正電子發(fā)射圖譜(PET)研究發(fā)現(xiàn)，在疾病發(fā)生的早期即出現(xiàn)特異性的尼古丁受體減少，這與AD患者認(rèn)知功能關(guān)系的改變有著密切關(guān)系〔27〕。研究表明在AD患者的大腦皮層的nAChR的含量明顯減少〔28〕。Guan等〔29〕研究也發(fā)現(xiàn)Aβ25-35和Aβ40均可抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中尼古丁受體基因的表達(dá),還調(diào)節(jié)多種其他受體的功能，并具有對抗神經(jīng)細(xì)胞毒素性神經(jīng)保護(hù)作用〔30〕。已經(jīng)證實(shí)患者腦組織多個(gè)區(qū)域中尼古丁受體水平降低〔26〕。受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AD患者大腦尼古丁受體密度降低，與大腦顳葉皮質(zhì)SPs的增多程度呈負(fù)相關(guān)。

Paterson等〔31〕報(bào)道AD患者腦中高親和力的尼古丁受體數(shù)目明顯的下降，在以后的尸檢和活檢中也發(fā)現(xiàn)了尼古丁受體的明顯降低。AD患者腦組織中nAChR水平明顯降低，該受體在 AD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究表明α7 nAChR功能與大腦學(xué)習(xí)和記憶能力有關(guān)，并具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用〔32，33〕。

在研究中發(fā)現(xiàn)，AD病人尸解后腦組織中，海馬和大腦皮層區(qū)域尼古丁受體a4亞單位蛋白質(zhì)水平分別較同齡對照組降低了35%和47%；α3亞單位分別降低29%和35%；α7亞單位亦有明顯降低；但β2亞單位與對照組相比無明顯的差異。很多實(shí)驗(yàn)也得到相似結(jié)果〔34，35〕。我們的研究顯示，經(jīng)Aβ腦室注射的大鼠腦組織中，尼古丁受體α7亞單位較對照組明顯降低，說明 Aβ1～42能夠引起α7亞單位蛋白水平表達(dá)降低。

nAChR亞單位除了與大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)外，還具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用〔27〕。大量研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)性受體與APP的代謝過程有密切聯(lián)系，在AD的發(fā)病中起著重要的作用〔36〕。其中α7nAChR與AD的發(fā)生關(guān)系密切，具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，但其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制并不清楚。在APPSWE轉(zhuǎn)基因大鼠腦標(biāo)本中可見α3nAChR的選擇性升高，提示α3nAChR的升高是對Aβ毒性作用的一種保護(hù)機(jī)制。

4 結(jié) 論

目前的研究已經(jīng)證實(shí)尼古丁受體與很多大腦功能有關(guān)，而AD發(fā)生時(shí)有上述功能的損害并有nAChR數(shù)量的減少和表達(dá)的低下，因此可以說在AD的發(fā)生和發(fā)展中nAChR起著重要的作用。在Aβ代謝過程中的關(guān)鍵酶即γ-分泌酶是Aβ代謝的關(guān)鍵酶，是其代謝的最后一步，也是產(chǎn)生不溶性片段的關(guān)鍵酶，而目前對Aβ的代謝水平研究上γ-分泌酶的研究比α和β分泌酶更有前景，所以γ-分泌酶的研究是為AD的治療提供新的靶點(diǎn)。

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