血管內(nèi)皮生長因子與血府逐瘀湯促血管新生的比較研究＊

蘇曉艷，宋 軍，高 冬

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700;2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350108)

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有顯著的促血管新生功效，是促血管生長的代表性藥物。臨床上通過人為影響VEGF的水平，可以改變機(jī)體血管新生的狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)促血管新生、治療缺血性疾病的作用，達(dá)到“治療性血管新生”的目的，但其臨床實(shí)驗(yàn)及研究中潛在的副作用制約其推廣應(yīng)用。近年來，隨著中醫(yī)藥在血管新生領(lǐng)域研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)許多活血化瘀方藥均具有較好的促血管新生作用，其中臨床常用的活血化瘀經(jīng)典方血府逐瘀湯就是代表方藥之一。查閱系列綜合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯促血管新生作用與VEGF存在較大差異，本文擬通過分析兩者之間的異同，以期盡快打破血管新生臨床治療中的瓶頸問題，最大程度地發(fā)揮兩者在血管新生方面的作用，為今后的基礎(chǔ)和臨床研究找尋方向。

1 VEGF與血管新生

1.1 VEGF分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性

1971年Folkman等［1］提出血管新生生長因子及其治療應(yīng)用，引發(fā)國內(nèi)外學(xué)者對VEGF家族結(jié)構(gòu)、受體及生物學(xué)特性展開了系統(tǒng)研究。VEGF家族可由血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，是一組與血管新生密切相關(guān)的多肽類生長因子的總稱。VEGF家族包括 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子(PIGF)和VEGF-F［2］。作為一種內(nèi)皮細(xì)胞高度特異性的有絲分裂素，必須與其同源受體、即VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR，F(xiàn)lk-1)、VEGFR-3 和 Neuropilins(NRP-1和NRP-2)結(jié)合，激活一系列信號通路才能發(fā)揮生理作用。

VEGF生物學(xué)特性表現(xiàn)為高度特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、出芽、遷移和形成血管腔［3］;而且能有效延長生理性和腫瘤血管新生過程中內(nèi)皮細(xì)胞的壽命［4］，通過PI-3K-Akt通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bcl-Al等抗凋亡蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用［5］，VEGF還能夠誘導(dǎo)合成內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)，增加NO的釋放，從而引起血管舒張［6］，提高血管通透性。

1.2 VEGF在治療性血管新生中的應(yīng)用

自1935年提出血管新生(Angiogenesis)的概念以后，血管新生在治療缺血性疾病的研究中扮演著重要角色，在其眾多影響因素中，VEGF有著舉足輕重的地位。缺血、缺氧、炎癥刺激和機(jī)械損傷等刺激因素可以誘導(dǎo) VEGF轉(zhuǎn)錄，增加其穩(wěn)定性，上調(diào)VEGF及其受體的表達(dá)，從而提高其生理活性，加強(qiáng)建立側(cè)支循環(huán)來彌補(bǔ)機(jī)體血供的短缺，但機(jī)體自身的調(diào)節(jié)通常不足以彌補(bǔ)疾病發(fā)生時血供的短缺。醫(yī)學(xué)上通過人為影響促血管新生因子特別是VEGF的水平來治療血管相關(guān)性疾病，即“治療性血管新生”被廣泛運(yùn)用于缺血性疾病的治療。在實(shí)驗(yàn)動物評價研究中，楊冀萍［7］等采用大鼠腦動脈阻塞(MCAO)模型，以免疫熒光雙標(biāo)及激光共聚焦方法檢測梗死側(cè)灶周區(qū)活細(xì)胞和微血管數(shù)量。與對照組及假手術(shù)組比較，術(shù)后第7天及第14天經(jīng)鼻給予VEGF可明顯改善大鼠神經(jīng)功能，且術(shù)后第14天VEGF組梗死灶周區(qū)活細(xì)胞和微血管數(shù)量與對照組比較顯著增高(P＜0.01)?？梢姡?jīng)鼻給予VEGF可促進(jìn)局灶性腦缺血后梗死灶周區(qū)血管再生，促進(jìn)梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)。

治療性血管新生不但在動物實(shí)驗(yàn)中有效，而且已經(jīng)用于臨床研究。在缺血的心肌區(qū)域聯(lián)合注射VEGF165和血管生成素Ang-1，可增加內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞數(shù)量，從而促進(jìn)血管新生［8］，改善左心功能。VEGF在缺血性心臟病中的應(yīng)用曾被形象地稱作是“藥物促進(jìn)心臟的自身搭橋”。為了能讓患者體內(nèi)持續(xù)表達(dá) VEGF，Isner等［9］對下肢動脈硬化缺血病人通過球囊導(dǎo)管將重組VEGF的質(zhì)粒導(dǎo)入缺血部位，使多數(shù)病人靜息疼痛明顯減輕，4周后血管造影顯示缺血下肢側(cè)支動脈明顯增加，缺血部位的血供得到改善。James F Symes等［10］采用心肌內(nèi)直接注射編碼人VEGF165(phVEGF165)對藥物難治且不適合手術(shù)治療的心絞痛患者進(jìn)行了I期臨床試驗(yàn)，并評估其安全性和生物活性。他們通過一個微型左前開胸手術(shù)將phVEGF165直接注射到III級或IV級心絞痛患者心肌中，隨訪90 d后，16例患者心絞痛癥狀緩解，硝酸甘油用量減少(硝酸甘油使用/周 =60.2 ±4.9 術(shù)前 vs 3.5 ±1.6 90 d)，70%患者的心絞痛完全消失達(dá)6個月，顯示出藥物在不適合手術(shù)的冠狀動脈疾病上具有良好的臨床應(yīng)用前景。

1.3 VEGF促血管新生的瓶頸

雖然上述實(shí)驗(yàn)證明VEGF在治療性血管新生的臨床應(yīng)用中是安全有效的，但部分臨床研究發(fā)現(xiàn)VEGF的應(yīng)用存在著一些嚴(yán)重的副作用。對昏迷行氣管插管的大鼠注射VEGF(250 μg/kg)后，通過內(nèi)皮細(xì)胞源性NO介導(dǎo)，引發(fā)劑量依賴性的血管擴(kuò)張［11］，大鼠出現(xiàn)一過性的心動過緩、低血壓和心輸出量明顯下降的問題［12］。另外，由于VEGF不僅作用于正常血管的發(fā)育及生長，還參與病理性血管新生過程，VEGF的高表達(dá)可能加重病理性血管生長或誘發(fā)血管增生性疾病。在缺血性心血管疾病的治療中，VEGF可同時加速粥樣斑塊內(nèi)的血管生成，促進(jìn)斑塊擴(kuò)張生長，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，出現(xiàn)Janus現(xiàn)象并加速動脈粥樣硬化的形成［13］。近年來的研究還表明，VEGF基因5’非編碼區(qū)具有誘發(fā)腫瘤的作用［14］。若實(shí)體瘤超過1 mm3而瘤體內(nèi)無新生血管，僅依賴周圍組織的彌散作用來供給營養(yǎng)時，腫瘤生長極其緩慢或處于“休眠”狀態(tài)。一旦腫瘤組織內(nèi)出現(xiàn)新生血管支持，腫瘤將會迅速成長。在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，VEGF持續(xù)的促血管生長作用會導(dǎo)致腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，以及其他血管生成源性疾病如視網(wǎng)膜病變等危險［15，16］。上述原因制約了VEGF在治療性血管新生中的臨床應(yīng)用，嚴(yán)重阻礙了VEGF的臨床轉(zhuǎn)化。

2 血府逐瘀湯與血管新生

2.1 血府逐瘀湯具有促進(jìn)血管新生的作用

血府逐瘀湯出自清·王清任的《醫(yī)林改錯》，是其5個逐瘀湯中應(yīng)用最廣的1首方劑，也是近10多年來醫(yī)藥界研究較多的活血化瘀成方。臨床運(yùn)用涉及各種缺血性疾病的防治，如冠心病、缺血性腦血管病、動脈粥樣硬化等。離經(jīng)之血停于體內(nèi)，血行不暢、血脈凝滯以形成瘀血。早期藥理學(xué)研究表明，血府逐瘀湯可改變血液凝固性和血液流變性，具有舒張血管、降低血管阻力，同時改善毛細(xì)血管通透性、保護(hù)心肌細(xì)胞等多種藥理作用［17］。從活血化瘀的角度闡述血府逐瘀湯治療缺血性疾病的機(jī)制。

近年來，隨著研究的深入，課題組通過雞胚絨毛尿囊膜(CAM)篩選十幾種活血化瘀中藥，發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯具有較好的促血管新生作用［18］。在此基礎(chǔ)上開展的系列研究顯示，高劑量的血府逐瘀湯通過NO誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移至缺血區(qū)，發(fā)揮了促血管新生的作用，改善了局部缺血、壞死的狀況，避免了患肢出現(xiàn)肌肉萎縮［19］。體外實(shí)驗(yàn)表明，血府逐瘀湯含藥血清對內(nèi)皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化、形成血管腔等涉及血管新生的多個環(huán)節(jié)均有顯著促進(jìn)作用［20～22］。另該方劑還能激活造血干細(xì)胞［23］，提高造血能力。這部分研究從活血生新的角度進(jìn)一步闡述血府逐瘀湯的藥效機(jī)制［24］。

2.2 血府逐瘀湯適度調(diào)控血管的生長

有趣的是，血府逐瘀湯不論體內(nèi)還是體外都表現(xiàn)出短暫的促進(jìn)血管生長的作用。在下肢缺血大鼠模型中，該藥僅能增加肉芽組織內(nèi)血管數(shù)量，加快早期修復(fù)速度，對肌肉組織中的血管數(shù)量并不影響。隨著肉芽組織纖維化，增生血管閉塞、退化和消失［19］，避免了長期血管增生的問題。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯促內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的藥效濃度和時間曲線呈倒U型［21］，僅2.5%含藥血清作用48 h為最佳促血管生長條件。隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，其藥效作用消失，甚至出現(xiàn)相反的抑制作用［22］。丁志山等［25］研究結(jié)果顯示，含藥血清濃度≧10%，血府逐瘀湯抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，同樣得到高濃度藥物抑制血管新生的結(jié)論。由此可見，血府逐瘀湯并不是一味地促進(jìn)血管新生，而是具有調(diào)控血管適度生長的作用。該針對性的調(diào)控機(jī)制，可能是藥物長期臨床實(shí)踐未見副作用的主要原因，也是能用于輔助治療腫瘤［26］的重要原因。

2.3 血府逐瘀湯治療性血管新生研究中難點(diǎn)

血府逐瘀湯為中藥復(fù)方中的大方，藥物成分較多、組方復(fù)雜、作用機(jī)制呈多途徑、多靶點(diǎn)、多層面的復(fù)雜特點(diǎn)。雖然部分實(shí)驗(yàn)初步揭示其促血管新生的作用機(jī)理［20～22］，但由于血管新生是一個極為復(fù)雜的過程，涉及眾多的調(diào)控因子，且各因子所介導(dǎo)的通路之間還能相互影響，形成一個復(fù)雜難解的網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)。目前對該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)知之不多，故建立在此基礎(chǔ)上的血府逐瘀湯調(diào)控血管適度生長的機(jī)制研究基礎(chǔ)薄弱，難于攻破。另外，中藥臨床使用個體化要求高，血府逐瘀湯能否作為促血管生長的“工具藥”統(tǒng)一使用?抑或藥物是否開展二次開發(fā)和組方的加減均需要結(jié)合明確的機(jī)制，通過大量深入的基礎(chǔ)和規(guī)范性臨床研究才能給出較為明確的答案。

總之，VEGF成分單一、結(jié)構(gòu)明確，促血管新生作用靶點(diǎn)及作用途徑較明確，對缺血性疾病的治療針對性強(qiáng)且療效顯著，但其一味促血管生長的作用特點(diǎn)帶來臨床明顯的副作用，其安全給藥方式、給藥劑量和給藥時間不易掌控。雖然血府逐瘀湯調(diào)控血管適度生長的優(yōu)勢能克服VEGF的副作用，但其復(fù)方成分眾多，并非單一組分，致使其作用機(jī)制復(fù)雜難解，還需要長期深入的研究，才有望在明確作用靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，趨利避害，通過調(diào)整處方人為地掌控治療作用，增強(qiáng)處方作用的可控性。

［1］Folkman J.Tumor angiogensis:therapeutic implications［J］.N Engl J Med，1971，285(21):1182-1186.

［2］AL Kolodkin，DV Levengood，EG Rowe，et al.Neuropilin is a semaphorin III receptor［J］.Cell，1997，90(4):753-762.

［3］N Ferrara，HP Gerber，J LeCouter.The biology of VEGF and its receptors［J］.Nature medicine，2003，9669-9676.

［4］HP Gerber，V Dixit，N Ferrara Ferrara.Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Al in Vascular endothelial cells［J］.J.Biol.Chem，1998，273:13313-13316.

［5］D Fulton， JP Gratton， TJ McCabe，etal. Regulation of endothelium-derived nitric oxide production by the protein kinase Akt［J］.Nature，1999，399(6736):597-601.

［6］HP Gerber， A McMurtrey， JKowalski， etal. Vascular Endothelial Growth Factor Regulates Endothelial Cell Survival through the Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Signal Transduction Pathway REQUIREMENT FOR Flk-1/KDR ACTIVATION［J］.Journal of Biological Chemistry，1998，273:30336-30343.

［7］楊冀萍，劉懷軍，程曦，等.經(jīng)鼻給予血管內(nèi)皮生長因子對腦梗死大鼠梗死灶周區(qū)血管新生的影響［J］.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2009，16(3):195-198.

［8］劉翔，陳亦江，張馥敏，等.VEGF165和Ang-I協(xié)同改善急性心梗大鼠心功能［J］.中華胸心血管外科雜志，2005，10(21):295-297.

［9］Isner JM，Investigator P，Walsh K，et al.Arterial gene therapy for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral arterial artery-disease［J］.Circulation，1995，91(11):2687-2692.

［10］James F Symes，Douglas W Losordo，Peter R Vale，et al.Gene therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease［J］.The Annals of Thoracic Surgery，1999，68(3):830-836.

［11］D.D.Ku ，J.K.Zaleski，S.Liu，et al.Vascular endothelial growth factor induces EDRF-dependent relaxation in coronary arteries American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，1993，265:H586-H592.

［12］Yang，Renhui;Thomas，G.Roger;Bunting，Stuart，et al.Effects of vascular endothelial growth factor on hemodynamics and cardiac performance［J］. Journal of Cardiovascular Pharmacology，1996，27(6):838-844.

［13］Epstein SE，Stabile E，Kinnaird T，et al.Janus phenomenon:the interrelated tradeoffs inherentin therapies designed to enhance collateralformation and thosedesigned toinhibit atherogenesis［J］.Circulation，2004，109(23):2826-2831.

［14］Masuda K，Teshima-kondo S，Mukaijo M，et al.A Novel Tumor-Promoting Function Residing in the 5’Non-coding Region of vascular endothelial growth factor mRNA［J］.Plos Medicine，2008，5(5):815-822.

［15］Schwarz ER，Speakman MT，Patterson M，et al.Evaluation of the Effects of Intramyocardial Injection of DNA Expressing Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)in a myocardial Infarction Model in the Rat-Angiogenesis and Angioma Formation［J］.Journal of the American College of Cardiology，2000，35(5):1323-1330.

［16］K Ohno-Matsui， A Hirose， S Yamamoto， et al. Inducible expression of vascular endothelial growth factor in adult mice causes severe proliferative retinopathy and retinal detachment［J］.The American Journal of Pathology，2002，160(2):711 –719.

［17］蘇丹，姚麗.血府逐瘀湯的現(xiàn)代藥理學(xué)研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2013，41(3):172-175.

［18］高冬，宋軍，胡娟，等.活血化瘀中藥對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(10):912-915.

［19］高冬，焦雨歡，武一曼，等.血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞參與缺血區(qū)血管新生的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32(2):224-228.

［20］GAO Dong，WU Li-ya，JIAO Yu-huan，et al.The Effect of Xuefu Zhuyu Decoction on in vitro Endothelial Progenitor Cell Tube Formation［J］.Chin J Integr Med，2010，16(1):50-53.

［21］高冬，宋軍，陳文元，等.血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞促血管新生的基因調(diào)控研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，30(2):153-156.

［22］Song J，Chen WY，Wu LY，et al.A microarray analysis of angiogenesis modulation effect of Xuefu Zhuyu Decoction on endothelial cells［J］.Chin J Integr Med，2012，18(7):502-506.

［23］高冬，林久茂，鄭良樸，等.血府逐瘀湯影響小鼠骨髓造血干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27(6):527-530.

［24］高冬，宋軍.從活血化瘀到活血生新［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33(5):581-582.

［25］丁志山，高承賢，程東慶，等.血府逐瘀湯對牛內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響［J］.中成藥，2003，25(5):423-424.

［26］祁艷波，吳嘉慧，劉柏楊，等.血府逐瘀湯對荷瘤小鼠的抑瘤作用［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32(5):446-448.