酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結(jié)果的影響因素和應(yīng)對措施

張春艷

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結(jié)果的影響因素和應(yīng)對措施

張春艷

（吉林省白城市中心血站，吉林 白城 137000）

酶聯(lián)免疫吸附試驗；影響因素；應(yīng)對措施

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是血站檢驗獻血者血液是否符合既定標準的常用檢測方法，其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面進行酶標記的抗原抗體反應(yīng)，用洗滌法洗除液相中的游離成分。因其具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、達納克水平和經(jīng)濟安全等優(yōu)勢，廣泛為臨床實踐所應(yīng)用。但在檢驗實際操作過程中，在各種主客觀因素的影響下，可影響檢測結(jié)果的準確性。為此，筆者總結(jié)分析ELISA試驗操作各個環(huán)節(jié)中容易出現(xiàn)的問題和注意事項，以不斷提高檢驗質(zhì)量，滿足各種需求。

1 試劑的準備

目前各種ELISA試驗均有商品化的專用試劑盒。應(yīng)選擇質(zhì)量優(yōu)良、有批準文號的檢測試劑，試劑必須在有效期內(nèi)使用，實際操作時嚴格執(zhí)行試劑說明書。試劑從冰箱取出后，應(yīng)放在室溫或37 ℃條件下30 min再進行檢測。保存試劑盒的冰箱應(yīng)經(jīng)常檢查儲存溫度并做好記錄，冰箱應(yīng)避免頻繁開關(guān)。試劑使用前應(yīng)搖勻。

2 標本的采集和保存

血站ELISA試驗所用標本均為血清，臨床上使用的標本還包括經(jīng)過預(yù)處理的唾液、尿液、糞便等生物材料。

對于含有免疫物質(zhì)的標本，可干擾試驗，使結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。干擾因素包括兩類，其中內(nèi)源性因素包括類風(fēng)濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白等，主要通過試劑的合理選擇予以有效避免。外源性因素包括標本溶血和凝固、被細菌污染、儲存時間過長等，實際工作中應(yīng)采取避免溶血[1]和污染的措施。否則，紅細胞溶解時會釋放具有過氧化物酶活性的亞鐵血紅素的血紅蛋白；應(yīng)避免污染標本，一旦污染菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，當(dāng)以HRP為標記時，可增加非特異性顯色而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。應(yīng)保持檢測標本處于新鮮狀態(tài)，需低溫保存推遲檢測標本，分別在2～8 ℃和低溫條件下保存7 d內(nèi)和7 d后檢測的血清標本。同時，反復(fù)冰融會使抗體效價降低，需多次測定抗體的血清標本應(yīng)采用少量分裝并冰存的保存方法。應(yīng)充分離心血清標本，否則可因纖維蛋白原的殘留使其在微孔吸附而致假陽性結(jié)果。

所以，實驗室人員應(yīng)按要求認真查對血清標本，拒收不符合要求的標本和申請單，為避免溶血要及時分離合格標本的血清，并保證其中不得混有大量纖維蛋白或細胞成分，保證檢測結(jié)果的準確性。不能及時檢測的標本要按要求保存并作好記錄，標本從冰箱取出后要按常規(guī)處理用于檢測。

3 加樣、育溫、洗滌、顯色和比色

3.1 加樣：在試驗操作中，加標本、加酶結(jié)合物和加底物為循序漸進的加樣流程。前者一般采用手工或者微量加樣器的方法加樣。但應(yīng)注意：①每次手工加樣前必須更換吸嘴以避免交叉感染；②為保證準確加樣，應(yīng)揣摩并熟練掌握加樣技巧；③必須定期維護和校準加樣器，因為使用時間過長，因機械磨損或推動桿內(nèi)血痂附著等原因造成加樣不準。加酶結(jié)合物和底物可直接滴加，一般不用微量加樣器。每次加樣時，為避免加在孔壁上部，應(yīng)置所加物于ELISA板孔的底部，不得出現(xiàn)濺出、產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象，加酶試劑后要用吸水紙輕輕擦拭吸干酶標板。加底物操作時，不得混用各試劑盒顯色劑，不得顛倒添加順序，不得濺出孔外。較多標本時，為避免因加樣板過多所致加樣后等待時間過長放入孵箱，尤其在較高室溫條件下操作要分批進行。最后為保證混勻，在微型振蕩器上震蕩1 min。

3.2 溫育：酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)是在固相表面發(fā)生的一系列反應(yīng)，只有經(jīng)過擴散后抗原抗體結(jié)合才能達到反應(yīng)的終點，可見溫育需要一定時間，也是檢測結(jié)果的關(guān)鍵影響因素之一，最為明顯的是弱陽性標本[2]。水浴法、微波輻射法和溫箱法為最常用的溫育方式，第一種方法能較好地解決周圍孔與中央孔因受熱不均衡所致吸光度誤差。37 ℃適合大多數(shù)抗原抗體反應(yīng)是最常用的溫度，另外尚可采用是4 ℃、室溫和43 ℃。為了迅速平衡各板溫度，可使反應(yīng)板漂浮在水浴箱水面上，但不得疊放；反應(yīng)板應(yīng)加蓋或貼封紙，目的在于防止標本或稀釋液蒸發(fā)在孔壁上吸附。應(yīng)準確掌握溫育的溫度和時間，因為溫度不準影響反應(yīng)過程，時間過長可在反應(yīng)孔周圍出現(xiàn)非特異性結(jié)合導(dǎo)致花板，這難以徹底洗滌。

3.3 洗滌：影響ELISA檢測結(jié)果準確性的關(guān)鍵因素之一是洗滌。操作者應(yīng)嚴格按照要求洗滌，將游離酶標志物和結(jié)合酶標志物分離開來，可以將殘留在板孔中沒有參與反應(yīng)的物質(zhì)和反應(yīng)過程中吸附于固相載體的干擾物質(zhì)予以清除。要按要求設(shè)置自動洗板機洗板的時間、間隔、次數(shù)，次數(shù)較少可造成殘留出現(xiàn)假陽性結(jié)果，次數(shù)過多可洗脫抗原抗體結(jié)合物出現(xiàn)假陰性結(jié)果[3]。要保證洗液注滿各孔，防止在反應(yīng)孔中形成氣泡而造成洗滌不充分。洗板結(jié)束后，應(yīng)在干凈無塵的吸水紙上輕輕拍干。如洗液量不足，影響洗板效果，可堵塞洗板針，不完全抽吸，洗板不暢，不能徹底洗板。

3.4 顯色：顯色是酶催化底物由無色到有色的過程，影響檢測結(jié)果準確性的因素為反應(yīng)的溫度和時間。在一定時間內(nèi)，溫度適當(dāng)提高，陰性孔可保持無色，隨時間延長陽性孔則呈色加強。在定量檢測中，力求準確掌握底物加入后的反應(yīng)溫度和時間。為減少實驗誤差，提高臨界值樣本的分析準確度，因肉眼直接判斷結(jié)果存在個體差異應(yīng)盡量避免，最好通過酶標儀觀察測定顯色結(jié)果。應(yīng)注意，加顯色劑時，要保持顯色劑不外流。加終止液時應(yīng)避免產(chǎn)生較多氣泡，否則可能使假陽性結(jié)果的出現(xiàn)概率增加。

3.5 比色：目視法簡單明了，但對同一標本結(jié)果判定有一定的個體差異，甚或截然不同的結(jié)果。比色的結(jié)果通常用光密度表達，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度表達。但不應(yīng)在陽光或強光照射下安置酶標儀，應(yīng)在15～30℃室溫條件下進行操作，使用前要先預(yù)熱15～30 min儀器，確保檢測結(jié)果的準確性。比色前，應(yīng)將板底附著的液體用潔凈的吸水紙擦拭干凈，然后將其放在酶標儀的比色架上。

4 固相載體和抗原

4.1 固相載體：進行酶標記測定的基本條件是吸附于固相載體中的可溶性抗原或抗體變?yōu)椴蝗苄问?，聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反?yīng)板及塑料管為常用固相載體。微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，但每批微量反應(yīng)板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。因此，在使用每批制品前，必須經(jīng)過實驗室鑒定合格后方可使用。鑒定的方法：按規(guī)定隨機抽取每批固相載體，包被用0.2 μg/mL純化正常人IgG，洗滌后加酶標記抗人球蛋白進行反應(yīng)，再經(jīng)孵育洗滌，加底物顯色終止反應(yīng)后，在酶標比色計中逐孔測定其消光值和光密度值。鑒定標準：一般認為，全板中每兩孔間光密度值誤差在10%以下為合格；如果中間孔光密度值與四周孔相差較大，或者反應(yīng)板的一邊光密度值與另一邊凹孔相差較大，均不合格；檢查陽性和陰性參考血清光密度值的差異在10倍左右為合格。微量反應(yīng)板或塑料管在使用前用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用，不一定經(jīng)過特殊處理。

4.2 抗原：抗原或抗體包被于固相載體表面，其來源和制備方法可影響檢測結(jié)果的準確性?？乖蟊仨毧扇?、優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定，具有高純度和高免疫原性。當(dāng)抗原純度不高時，其中的雜質(zhì)會競爭固相載體上的有限位置，使其敏感性和特異性下降；制備包被抗原時，其免疫學(xué)活性不應(yīng)受到破壞。一般能用于補體結(jié)合試驗的可溶性抗原均可用于ELISA，在作ELISA時，必須要有1～2種試劑、要求純化，但在包被用表面活性劑提取的抗原前必須將表面活性劑透析除去，否則難以吸附到固相載體上。包被固相載體時要用濃度適當(dāng)?shù)目乖蚩贵w蛋白，如濃度太高則抗體效價低，可能測不出來；過量包被形成多層抗原吸附，可能造成脫落，檢測結(jié)果的敏感性和可重復(fù)性得以降低。

5 實驗人員素質(zhì)因素

人員素質(zhì)是影響檢驗結(jié)果的首要因素。思想素質(zhì)、業(yè)務(wù)素質(zhì)、心理素質(zhì)、身體素質(zhì)組成實驗室人員的主要素質(zhì)。首先，實驗人員的思想素質(zhì)應(yīng)良好，因為其服務(wù)對象包括獻血者和受血者，其道德水平直接關(guān)系到人們的健康和生命安危。所以，必須應(yīng)該熱愛專業(yè)，耐心細致，一旦出現(xiàn)如標本混淆、報告單記錄錯誤等現(xiàn)象，可能危害受血者的身心健康；其次，實驗人員應(yīng)有高超的業(yè)務(wù)素質(zhì)。要熟練掌握本專業(yè)的基本理論和基本操作技能，認真學(xué)習(xí)檢驗醫(yī)學(xué)前瞻性知識，不斷提高自己的業(yè)務(wù)能力和水平，適應(yīng)崗位需求。心理素質(zhì)要求檢驗人員應(yīng)勇于面對工作生活中的挫折和壓力，有條不紊，冷靜沉著地開展各項檢驗工作。

綜上所述，保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件是具有優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作。在實際應(yīng)用過程中，操作者必須熟練掌握基本操作技能，嚴格仔細的核查每個環(huán)節(jié)，盡量避免假陽性和假陰性反應(yīng)的出現(xiàn)，保證檢測結(jié)果真實可靠。

[1] 孫鑫,陳彥,張繼瑜,等.不同程度溶血對ELISA法檢測血清HBVM的影響[J].世界感染雜志,2004,4(2):174-176.

[2] 徐錫霞,鄧巍.溫育條件對ELISA定性測定HBsAg結(jié)果的影響[J].實用肝病雜志,2005,8(1):16-18.

[3] 劉祖勇.增加洗板次數(shù)對HBsAg ELISA檢測影響[J].中國輸血雜志,2006,19(2):135-136.

R446

A

1671-8194（2014）29-0393-02