胱抑素C及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

葉余輝

（廣西北海市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 北海 536000）

胱抑素C及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

葉余輝

（廣西北海市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 北海 536000）

收集并比較關(guān)于胱抑素C及其測(cè)定方法的相關(guān)資料，探討其生物學(xué)特性，檢測(cè)方法的種類，特點(diǎn)及影響因素。胱抑素C水平是反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的可靠指標(biāo)，其診斷性能與菊糖清除率相當(dāng)，顯著優(yōu)于血尿素、血肌酐及內(nèi)生肌酐清除率。臨床多選擇膠乳增強(qiáng)透射免疫比濁法或膠乳增強(qiáng)散射免疫比濁法作為常規(guī)檢測(cè)胱抑素C的測(cè)定方法。

胱抑素C；測(cè)定方法；生物學(xué)特性；腎小球?yàn)V過(guò)功能

菊糖清除率一直被認(rèn)為是反映腎小球?yàn)V過(guò)率的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但菊糖是外源性物質(zhì)，測(cè)定方法繁雜，操作繁瑣，不能滿足對(duì)危急患者的快速檢測(cè)，因此尚未能在臨床上廣泛開展，使應(yīng)用受到了限制[1]。胱抑素C（cystatin C，cys C）即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，人體每日分泌量較恒定，相對(duì)分子質(zhì)量為13×103，由于相對(duì)分子質(zhì)量小，故可自由透過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜。原尿中cys C幾乎全部被近端小管上皮細(xì)胞攝取、分解，并不回到血液中，尿中僅排出微量，能很好的替代血肌酐而成為一種新的反映腎小球?yàn)V過(guò)率的理想標(biāo)志物[2]。本文就胱抑素C及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展概述如下。

1 胱抑素C的生物學(xué)特性

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cysteine proteinase inhibitor，CPI)由Anastasi等在1983年從雞蛋清中分離純化得到，目前中文多稱之為胱抑素C。它是一種堿性非糖化的低相對(duì)分子質(zhì)量分泌性蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為9.3，相對(duì)分子質(zhì)量為13×103，由122個(gè)氨基酸組成[3]。采用等電聚焦層析法可分離為CPIcⅠ和CPIcⅡ兩型。CPIcⅠ的一級(jí)結(jié)構(gòu)中只有一條肽鏈，含兩個(gè)蛋氨酸殘基和四個(gè)半胱氨酸殘基及分子內(nèi)二硫鍵。CPIcⅠ與CPIcⅡ具有相同的免疫學(xué)活性，對(duì)熱及堿性環(huán)境穩(wěn)定。二者的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有同樣的N端，故有人認(rèn)為CPIcⅡ是CPIcⅠ的磷酸化形式[4]。

胱抑素C的基因編碼位于人類第20號(hào)染色體短臂上，含3個(gè)外顯子，大約為7.3 KD，胱抑素C基因含有管家基因，因此能在所有組織恒定且持續(xù)地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。所有有核細(xì)胞均可合成胱抑素C并很快分泌到細(xì)胞外，無(wú)組織特異性，可分布于腎、肝、胰、腸、胃、肺及胎盤等幾乎全身所有組織，在腦脊液和精液中濃度最高，尿液最低[5]。

目前，對(duì)胱抑素C的生物學(xué)功能了解不多，其最重要的生理功能是調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶活性，在膠原代謝中能水解某些前激素蛋白，對(duì)組織蛋白酶B、瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、溶酶體釋放的組織蛋白酶H和L具有抑制作用。直接與胱抑素C基因突變有關(guān)的疾病是遺傳性腦出血伴淀粉樣變，可造成腦血管破裂、腦出血等嚴(yán)重后果。胱抑素C在人體內(nèi)每日分泌量較恒定，屬于內(nèi)源性物質(zhì)，其清除通過(guò)腎臟進(jìn)行，腎小球?yàn)V過(guò)率決定了血清胱抑素C的水平，因此血清胱抑素C可作為反映腎小球?yàn)V過(guò)率變化的內(nèi)源性標(biāo)志物，某些疾病可引起胱抑素C在人體其他體液中含量的變化[6]。

2 胱抑素C的測(cè)定方法

胱抑素C主要臨床應(yīng)用是作為腎小球?yàn)V過(guò)率標(biāo)志物，其測(cè)定方法很多，包括單向免疫擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法、熒光免疫法、時(shí)間分辨熒光免疫法、放射免疫法、膠乳顆粒法、膠乳增強(qiáng)免疫比濁法等。目前臨床多選擇膠乳增強(qiáng)免疫比濁法作為常規(guī)檢測(cè)胱抑素C的測(cè)定方法[7]。

2.1 單向免疫擴(kuò)散（SRID）：在混入一定量抗體的瓊脂中，使待測(cè)的抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，可溶性抗體與相應(yīng)抗原在比例適當(dāng)處出現(xiàn)肉眼可見的沉淀環(huán)或沉淀，根據(jù)沉淀環(huán)的直徑或沉淀的面積計(jì)算大小計(jì)算胱抑素C的含量。本法須手工操作、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，影響因素較多，靈敏度差，無(wú)法自動(dòng)化，不利于臨床應(yīng)用。

2.2 酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)：使抗原或抗體吸附在某種固相支持物表面，并保持其免疫活性，酶標(biāo)抗體或抗原在液相中催化底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來(lái)進(jìn)行胱抑素C含量的定量分析。本法為手工操作，不需要昂貴的儀器，試劑成本低，臨床應(yīng)用較廣，但不適合急診樣本的檢測(cè)[8]。

2.3 熒光免疫法(FIA)：在一定條件下，使用激發(fā)光照射待測(cè)物質(zhì)，當(dāng)待測(cè)物吸收一定的入射光后，可發(fā)射出較入射光波長(zhǎng)稍長(zhǎng)的光，根據(jù)發(fā)射光強(qiáng)度的大小計(jì)算胱抑素C的含量。本法需要昂貴的熒光免疫分析儀，試劑成本高，但靈敏度好，特異性強(qiáng)，結(jié)果快速、準(zhǔn)確，檢測(cè)低限為（1 μg/L）。

2.4 時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFIA）：用銪作標(biāo)志物，直接檢測(cè)血清中胱抑素C的含量，根據(jù)銪元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)，可有效地排除非特異性熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。由于需要特殊的儀器設(shè)備，且所需檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，難以在臨床普及應(yīng)用。

2.5 放射免疫法（RIA）：通過(guò)雜交瘤技，獲得胱抑素C的單克隆抗體而建立起來(lái)的胱抑素C的RIA測(cè)定方法，是利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原同抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)的方法。本法結(jié)果準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，靈敏度為（1.3 μg/L），線性范圍為（0.6～1.7 mg/L），試劑成本低。但試劑保存時(shí)間短，存在放射性污染，操作麻煩，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。

2.6 膠乳顆粒法：1994年Kaabanda等報(bào)道用膠乳顆粒法檢測(cè)胱抑素C。膠乳顆粒法是一種免疫比濁測(cè)定法，該法操作簡(jiǎn)便快速，變異系數(shù)和誤差小，易于自動(dòng)化，但檢測(cè)敏感度低（檢測(cè)限為150 μg/L）。

2.7 膠乳增強(qiáng)透射免疫比濁法（PETIA）：在膠體溶液中，抗原胱抑素C與其抗體特異性結(jié)合，生成不溶性抗原-抗體復(fù)合物粒子，使反應(yīng)溶液濁度增加，在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度改變，與標(biāo)準(zhǔn)品比較可計(jì)算出胱抑素C的濃度。本法可以利用生化分析儀進(jìn)行比濁測(cè)定，整個(gè)分析過(guò)程只需要幾分鐘。測(cè)定回收率在100%±20%范圍內(nèi)，測(cè)定值的變異系數(shù)小于10%，測(cè)定范圍0.4～8.0 mg/L，測(cè)定偏差不超過(guò)±10%。溶血、黃疸和脂濁標(biāo)本對(duì)測(cè)定結(jié)果沒有明顯干擾[9]。

2.8 膠乳增強(qiáng)散射免疫比濁法（PENIA）：在膠體溶液中，抗原胱抑素C與其抗體特異性結(jié)合，生成不溶性抗原-抗體復(fù)合物粒子，使反應(yīng)溶液濁度增加，使用散射比濁儀進(jìn)行散射比濁分析。檢測(cè)范圍為0.23～7.25 mg/L，回收率為95%～109%，批內(nèi)CV＜3.5%，批間CV＜5.0%，不受三酰甘油、膽紅素、血紅蛋白、類風(fēng)濕因子和骨髓瘤異常蛋白的影響。

上述研究表明，SRID、ELISA、RIA法用于測(cè)定胱抑素C所需時(shí)間長(zhǎng)，不能自動(dòng)化，不適用于大批量標(biāo)本和急診的檢測(cè)，且RIA法存在放射性污染。TRFIA、FIA法所用儀器昂貴，檢測(cè)成本高，未能在醫(yī)院廣泛使用。PETIA和PENIA法檢測(cè)的靈敏度雖然較其他方法低（150 μg/L），但是低于正常參考值下限，標(biāo)本溶血、黃疸和脂血對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響不大，回收率和重復(fù)性均在允許范圍之內(nèi)，能進(jìn)行自動(dòng)化分析，可作為臨床常規(guī)檢測(cè)方法。

3 胱抑素C的水平

國(guó)內(nèi)外對(duì)血清及各種體液胱抑素C的參考值進(jìn)行了研究，正常人血清胱抑素C為（0.96±0.20）mg/L，臍帶血為(2.08±0.33)mg/L，嬰兒：＜1個(gè)月為（0.18±0.04）mg/L，＜12個(gè)月為（0.39±0.09）mg/L，＞12個(gè)月為（0.72±0.29）mg/L。腦脊液為（5.371±0.36）mg/L，唾液為（1.22±0.67）mg/L，關(guān)節(jié)液為（1.27±0.41）mg/L，尿液為（0.11± 0.125）mg/L，精漿濃度最高平均為51 mg/L[10]。國(guó)內(nèi)研究者用PETIA法對(duì)健康受檢者進(jìn)行胱抑素C測(cè)定，結(jié)果男性為0.62～0.91 mg/L，女性為0.52～0.83 mg/L，且胱抑素C水平隨年齡增加而增加[11]。1～19歲年齡組為（1.016±0.130）mg/L，20～50歲年齡組為（1.023±0.114）mg/L，50歲以上組為（1.209±0.279）mg/L，50歲以上組增高較明顯[12]。參考值的確定需要根據(jù)實(shí)際使用的檢測(cè)方法、試劑及本地實(shí)際情況建立。

4 胱抑素C測(cè)定的影響因素

樣品在25 ℃室溫保存可穩(wěn)定6 d，2～8 ℃密封保存，可穩(wěn)定12 d，-80 ℃可保存14個(gè)月，忌反復(fù)凍融。影響測(cè)定結(jié)果的主要因素是實(shí)驗(yàn)方法及其參考曲線的制定，與性別，年齡，身高、體質(zhì)量無(wú)關(guān)[13]。

5 胱抑素C的臨床應(yīng)用

胱抑素C主要應(yīng)用于反映腎臟腎小球?yàn)V過(guò)率。由于胱抑素C分泌恒定，濃度不受含蛋白質(zhì)飲食、身高、體質(zhì)量等影響，干擾因素較少，是反映腎小球?yàn)V過(guò)功能的可靠指標(biāo)。對(duì)腎衰竭的診斷比肌酐診斷早1～2 d[14]。血清胱抑素C水平對(duì)輕度腎功能損傷反映靈敏，用來(lái)評(píng)價(jià)糖尿病患者的腎功能狀況和對(duì)腎移植患者出現(xiàn)排斥反應(yīng)提供早期診斷[15]。一些研究發(fā)現(xiàn)，孕婦、重度燒傷、多發(fā)性骨髓瘤、過(guò)敏性紫癜患者的早期腎損害中胱抑素C也是很理想的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[16-19]。在肝臟疾病中胱抑素C水平顯著升高[20]。此外，在高血壓、心腦血管疾病、腦膜炎、惡性腫瘤的鑒別診斷等方面也有良好的應(yīng)用價(jià)值。

6 小 結(jié)

臨床胱抑素C檢測(cè)多用PETIA法，參考值的確定需要根據(jù)實(shí)際使用的檢測(cè)方法、試劑及本地實(shí)際情況建立。因此方法的標(biāo)準(zhǔn)化，試劑和標(biāo)準(zhǔn)品的統(tǒng)一，有助于方法學(xué)的比較和參考值的建立。胱抑素C與腎小球?yàn)V過(guò)率的線性關(guān)系優(yōu)于尿素、肌酐和內(nèi)生肌酐清除率，在各種疾病造成腎臟早期損害的診斷、治療及預(yù)防方面的應(yīng)用越來(lái)越廣，并且在其他疾病的診斷、治療和預(yù)防上也不斷的得到應(yīng)用。

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