宏基因組學(xué)與動物病原微生物檢測

吳舊生，王鵬歧，劉月環(huán)

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013)

宏基因組學(xué)(metagenomic)，又稱環(huán)境基因組學(xué)(environmental genomics)，檢測技術(shù)上不依賴培養(yǎng)，直接從微生物的天然環(huán)境中提取基因組DNA，對微生物群體進(jìn)行研究分析，最大限度地挖掘微生物資源。宏基因組學(xué)技術(shù)是尋找新基因、開發(fā)新的生物活性物質(zhì)、研究群落中微生物多樣性的新途徑， 目前已成為國際微生物學(xué)研究的熱點，本文對宏基因組學(xué)及其研究技術(shù)在人、動物微生物研究及檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，展望未來的發(fā)展趨勢和研究重點。

1 宏基因組學(xué)提出

迄今為止，人類對微生物世界的認(rèn)識基本上都集中在不到1%的微生物上，環(huán)境中絕大多數(shù)的微生物還未被研究過甚至是被知道，主要是因為99%以上的微生物目前都是 難 被純培養(yǎng)的[1]，這己經(jīng)成為現(xiàn)今微生物學(xué)界的普遍共識。Schmidt等[2]于1991年直接提取海水樣品DNA進(jìn)而構(gòu)建了λ噬菌體文庫，并進(jìn)行了16S rRNA基因的篩選分析。1996年，Stein等[3]克隆了40 kb的一種未知海洋古細(xì)菌的基因組片段，并進(jìn)行了測序分析，該項研究有里程碑式的意義。Handelman等[4]1998年提出一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法， 并首次使用了metagenomics(metagenome)這個名詞，中文譯為“宏基因組學(xué)”。文獻(xiàn)中的環(huán)境DNA文庫(Environmental DNA libraries)，土壤DNA文庫(soil DNA libraries)，eDNA文庫(eDNA libraries)，重組環(huán)境文庫(recombinant environmental libraries)，全基因組文庫(whole genome treasures)，群體基因組(community genome)，全基因組鳥槍法測序(whole genome shotgun sequencing)等都是相近的定義或名稱。宏基因組學(xué)(metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個整體來研究微生物與自然環(huán)境、或生物體之間的關(guān)系[5]。

2 宏基因組學(xué)的研究現(xiàn)狀、方法與困難

最初宏基因組學(xué)的基本研究策略是樣品和基因(組)的富集→提取特定環(huán)境中的基因組DNA→構(gòu)建宏基因組DNA文庫→篩選目的基因→目的基因活性產(chǎn)物表達(dá)。宏基因組學(xué)不僅克服了微生物難以培養(yǎng)的困難，結(jié)合生物信息學(xué)的方法，還可揭示微生物之間、微生物與環(huán)境之間相互作用的規(guī)律，大大拓展了微生物學(xué)的研究思路與方法，為從群落結(jié)構(gòu)水平上全面認(rèn)識微生物的生態(tài)特征和功能開辟了新的途徑。目前，微生物宏基因組學(xué)已經(jīng)成為微生物研究的熱點和前沿，廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)(氣候、水處理、極端環(huán)境、海洋資源)、人體(動物)腸道(含呼吸道、皮膚、生殖道)、石油污染修復(fù)、生物冶金等領(lǐng)域，取得了一系列引人矚目的重要成果。

宏基因組學(xué)的研究方法主要包括序列分析法、同位素探測技術(shù)和二代測序技術(shù)。

序列分析法 (sequence driven screening method)，又包括基于探針的探針雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)和焦磷酸技術(shù)等。探針雜交技術(shù)現(xiàn)用于土壤基因文庫的篩選[6]，被有效地用于鑒定系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中的標(biāo)志基因和帶有高度保守域的酶基因[7]。Sebat等[8]利用芯片技術(shù)對其所研究的微生物群落基因組進(jìn)行篩選， 鑒定出多個新的微生物種群。Wagner等[9]應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)對活性污泥中微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，獲得了大量新的信息，該方法的缺陷是低豐度微生物難以分析。而焦磷酸測序(pyro sequencing) 的出現(xiàn)則大大的提高了測序的效率[10]。

在復(fù)雜群落構(gòu)建的宏基因組文庫中找到特定的目的基因，需要篩選和測序成千上萬的克隆，通過同位素探測技術(shù) (stable isotope probing，SIP )研究特定代謝過程的生物基因組，克隆從SIP實驗中獲得的13C標(biāo)記的核酸，從而構(gòu)建一個因吸收了特定的基質(zhì)而在環(huán)境中執(zhí)行特定代謝功能的微生物宏基因組文庫，這極大地減少了需要篩選的克隆數(shù)量[11]，是目前在分子微生物(生態(tài)學(xué))領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛的方法之一。二代高通量測序廣泛應(yīng)用是宏基因組學(xué)得以長足發(fā)展的基礎(chǔ)，并使得宏基因組技術(shù)應(yīng)用于人類及各類家畜等動物的胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和功能研究[12]。

雖然宏基因組學(xué)研究正極大限度地發(fā)掘及發(fā)揮了人們難以想象到的微生物群落的巨大功能，然而它也面臨著一些困難。首先，不同的取樣和DNA提取方法決定了宏基因組研究的結(jié)果，如何對這些方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化是宏基因組學(xué)研究的一個難點。第二，由于許多基因或基因產(chǎn)物在外源宿主中不表達(dá)或表達(dá)后沒有活性，限制了后期的研究，因而建立更多的適于不同基因表達(dá)的宿主系統(tǒng)是基于功能篩選的宏基因組學(xué)研究的又一困難。第三，數(shù)據(jù)分析及生物信息學(xué)分析方法、微生物培養(yǎng)技術(shù)及模式微生物全基因組序列獲得等方面的規(guī)范有待于提高。因此，建立較規(guī)范宏基因組數(shù)據(jù)庫，供不同領(lǐng)域及各個國家的研究人員共享使用，將更有利于對宏基因組學(xué)研究結(jié)果的解釋和利用。

3 宏基因組學(xué)與人類疾病

人類消化道(包括胃腸道、口腔)，呼吸道、 泌尿生殖系統(tǒng)、皮膚等是各類微生物存在的天然場所，因此由其構(gòu)成的人類疾病的宏基因組學(xué)研究也相繼開展。如美國國立環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所( national institute of environmental health sciences，NIEHS ) 于1998年啟動了環(huán)境基因組計劃(environmental genome project，EGP)，意在就環(huán)境與基因相互作用及其對人類健康的影響進(jìn)行系統(tǒng)全面的研究，主要內(nèi)容包括環(huán)境脅迫對機(jī)體遺傳變異的過程和機(jī)理，發(fā)掘環(huán)境應(yīng)激和應(yīng)答基因的多態(tài)性及探討這些多態(tài)性基因的功能及其與患病風(fēng)險的關(guān)系。2007年美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)啟動的人類共生菌群基因組計劃(human microbiome project，HMP)正是這方面的深入展開的重要支持與表現(xiàn)。由我國科學(xué)家(華大基因公司)參加的歐洲人體腸道宏基因組研究計劃 (european metagenomics of the human intestinal tract，MetaHIT)，對124例歐洲人腸道菌群基因組樣本用新一代大規(guī)模高通量測序技術(shù)進(jìn)行深度測序，獲得330萬個人體腸道宏基因組的參考基因，約是人自身基因的150倍，這些基因信息可以估計人腸道中存在約1000～1150種細(xì)菌，這些細(xì)菌是絕大部分個體所共有的且是未知的[13]。

宏基因組技術(shù)提供了較為全面的菌種多樣性分布的特征，在研究探討人類疾病中不可培養(yǎng)的微生物多樣性已有了較大進(jìn)展，如Breitbart等[14]用鳥槍測序法對人體排泄物的宏基因組文庫進(jìn)行研究， 結(jié)果表明獲得的病毒大約有1200種基因型，大多數(shù)為新病毒， 可能與人類疾病有著密切的關(guān)系。Gill等[15]對2名健康成年人糞便標(biāo)本的DNA進(jìn)行測序后發(fā)現(xiàn)，僅有1%～5%的DNA不是來自細(xì)菌，消化道細(xì)菌的基因數(shù)量達(dá)60000 多種， 比在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的多出一倍，是由細(xì)菌和人體細(xì)胞組成的混合體，該研究結(jié)果對許多人類疾病的臨床診斷和治療研究具有深遠(yuǎn)的意義。Kurokawa等[16]對13個處于不同年齡層的健康人體糞便微生物種群進(jìn)行了研究， 表明未斷奶嬰兒的具有較大個體差異性， 而成人及已斷奶兒童則呈現(xiàn)出高度的功能一致性。2008年Finkbeiner等[17]通過構(gòu)建12個腹瀉小孩腸道內(nèi)容物宏基因組文庫， 發(fā)現(xiàn)得到的病毒序列與GenBank中的已知序列同源性很低。同時，利用二代測序技術(shù)對口腔、呼吸道、皮膚等部位的菌群及與相關(guān)疾病的宏基因組學(xué)研究也取得了較大進(jìn)展。Keijser等[18]利用高通量測序系統(tǒng)對多個健康人唾液及牙菌斑合并樣品的研究發(fā)現(xiàn)，總數(shù)為19萬個細(xì)菌的16S rRNA序列中，在唾液和牙菌斑中分別鑒定出185和267個細(xì)菌屬，分別涵蓋了5600和10000個不同菌種。Zaura等[19]對健康人口腔菌群的研究表明：利于健康的核心細(xì)菌數(shù)超過500種以上，使人們對口腔菌群細(xì)菌的數(shù)量有了新的認(rèn)識。Willner等[20]檢測了5名囊性肺纖維化病人和5名健康呼吸道的病毒宏基因組序列后發(fā)現(xiàn)，病人組檢測到175個獨特的病毒基因型，且以編碼芳香族氨基酸為主，提示呼吸性病毒與囊性肺纖維化有潛在的關(guān)系。Gao等[21]用16SrDNA測序的方法發(fā)現(xiàn)正常人群的手、身體表皮微生物群落呈現(xiàn)高度多樣性。

以上成果顯示，宏基因組學(xué)技術(shù)在探索人體與不可培養(yǎng)病原菌相互關(guān)系的研究方面將有著廣闊的應(yīng)用前景。

4 宏基因組學(xué)與動物免疫及致病

動物的胃腸道中存在著大量的共生微生物群落，構(gòu)成了動物消化道微生物區(qū)系，正常腸道微生物對宿主具有營養(yǎng)、免疫、生長刺激與生物拮抗等作用，它們通過寄主胃腸道中特定環(huán)境，利用種群間的互作，在動物胃腸道中形成一種穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境。長期以來，對于胃腸道微生物的研究是建立在純培養(yǎng)技術(shù)上[22]。宏基因組技術(shù)可以不依賴實驗室培養(yǎng)條件，有可能使人們更加全面地認(rèn)識腸道微生物的致病機(jī)制，尋找預(yù)防和治療的方法。

如利用宏基因組技術(shù)對倭蜂猴糞便微生物的結(jié)構(gòu)組成及其潛在功能研究表明，在人類所占比例較小的Proteobacteria和Actinobacteria在倭蜂猴中更為普遍，而在人類中的優(yōu)勢菌群Firmicutes在倭蜂猴中卻是少數(shù)。同時，通過對倭蜂猴與人及其他一些動物的胃腸道宏基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙向聚類發(fā)現(xiàn)，雖然倭蜂猴和小鼠腸道系統(tǒng)的功能有差異，但其微生物群落結(jié)構(gòu)卻最為相似[23]。Zhu等[24]通過分析大熊貓腸道微生物宏基因組，發(fā)現(xiàn)了包括纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等在內(nèi)的多種糖苷水解酶編碼基因，這些研究更進(jìn)一步證實了胃腸道微生物與其宿主之間的共同進(jìn)化，其代謝產(chǎn)物能影響宿主粘膜系統(tǒng)的發(fā)育、血管的發(fā)生、腸道上皮的更新、腸道功能的維持及參與宿主基因的表達(dá)[25]。

自Muyer等[26]1993年首次用變性梯度電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)(主要分析16S rRNA區(qū)段)分析土壤環(huán)境的微生物區(qū)系以來，該技術(shù)已廣泛用于人類、動物腸道微生態(tài)及其它環(huán)境微生態(tài)的研究[27-28]。典型的如高倩等[29]用DGGE法結(jié)合免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)方法研究了三種不同級別實驗小鼠(普通級小鼠，清潔級小鼠和SPF小鼠)腸道菌群組成與腸黏膜相關(guān)淋巴組織sIgA陽性細(xì)胞分布，結(jié)果表明普通小鼠腸道細(xì)菌種類、數(shù)量及sIgA陽性細(xì)胞分布數(shù)量及部位均為最多，與清潔級、SPF級小鼠有明顯差異。利用非培養(yǎng)法研究鱗翅目昆蟲模式動物—家蠶腸道內(nèi)容物發(fā)現(xiàn)家蠶腸道中寄生有16種以上的細(xì)菌[30]。Rawls等[31]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(Danio rerio)腸道中某些微生物可以刺激腸道上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)代謝，刺激斑馬魚自身免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)。

另外，胃腸道微生物被認(rèn)為是藥物、酶基因和其他新型產(chǎn)品的來源，目前國內(nèi)外研究者已通過構(gòu)建動物胃腸道微生物宏基因組文庫或?qū)昊蚪M進(jìn)行直接測序，成功篩選到多種糖苷水解酶及淀粉酶、脂酶/酯酶等酶類基因[32]?？傊柚诖笠?guī)模測序和生物信息學(xué)分析，在動物胃腸道微生物群落的宏基因組學(xué)方法中，發(fā)現(xiàn)大量過去無法得到的未知微生物的新基因或基因簇，大大拓展了研究范圍，積累了大量基因序列信息，這一新的研究思路的引進(jìn)，使得未來動物胃腸微生物間互作機(jī)理更加深入，使得研究動物胃腸道代謝定向調(diào)控成為可能，為動物性疾病防治、開發(fā)和利用動物胃腸道微生物資源提供了有力的技術(shù)支持。

5 宏基因組學(xué)在動物病原微生物研究上的應(yīng)用及策略

因為宏基因組學(xué)技術(shù)可以避開傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，在DNA水平來探討機(jī)體，機(jī)體微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境微生物的關(guān)系，利用此法可快速可靠地獲得體內(nèi)、體表(胃腸道、呼吸道、口腔、生殖道、皮膚)微生物中各種微生物的菌落指紋和特征性核苷酸序列，為疾病診斷和微生物資源發(fā)掘提供信息與依據(jù)，而且宏基因組方法多數(shù)是基于核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等檢測方法，自動化程度高，可以準(zhǔn)確靈敏地鑒定病原微生物，未來宏基因組學(xué)在病原微生物研究與診斷疾病方面的發(fā)展和應(yīng)用可能主要集中在以下幾個方面：

5.1 利用營養(yǎng)和生境差異選擇性富集目的基因組

在宏基因組文庫篩選過程中目的基因僅占總DNA的一小部分，如何獲得這些腸道固有微生物的基因組并有效地減少宿主的基因組和外源DNA干擾是研究動物腸道微生物宏基因組的關(guān)鍵。為提高檢出率，需要對樣品進(jìn)行預(yù)富集。目前預(yù)富集技術(shù)主要分為細(xì)胞水平富集和基因組水平富集。使用較多的是營養(yǎng)選擇及物理化學(xué)指標(biāo)選擇來富集目的基因組(盡管這樣做丟失了菌種的多樣性)，基本做法是通過利用選擇培養(yǎng)基對目的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)， 如用 42 羥基丁酸作唯一的碳源和能源篩選到能夠穩(wěn)定利用42羥基丁酸的克隆子， 經(jīng)分析這些克隆子具有42羥基丁酸脫氫酶活性， 據(jù)此可以利用該基因編碼的活性物質(zhì)開展實驗室純培養(yǎng)[33]。對于一些不可純培養(yǎng)的病原微生物，實驗動物上典型的如泰澤菌(Tizzer)，可以以其致病靶器官(組織)為樣品，構(gòu)建和篩選宏基因組文庫進(jìn)行富集，再利用克隆測序或直接二代測序的方法來檢測鑒定，增加了病原微生物檢出的機(jī)會。

5.2 宏基因組數(shù)據(jù)庫的建立

對于病原微生物的檢測和研究，一部分工作需要做流行病學(xué)調(diào)查，因此描述疫源地病原微生物群落的基本特征，明確各生境下微生物群落的宏基因組學(xué)特征是關(guān)鍵的第一步，也相當(dāng)于為大規(guī)模利用高通量檢測技術(shù)進(jìn)行預(yù)篩選和為應(yīng)急快檢提供標(biāo)準(zhǔn)品，其中的基因組特征(如16SrRNA序列的比對分析，是細(xì)菌種屬的鑒定與群體調(diào)查分析的有效手段)、生物信息數(shù)據(jù)及描述規(guī)范就成為未來動物病原檢測的重要內(nèi)容和結(jié)果判定的依據(jù)。

5.3 高通量篩選

高通量測序技術(shù)和基因芯片技術(shù)作為宏基因組學(xué)最為成熟的重要技術(shù)，其全面性、準(zhǔn)確性以及信息的深入程度都令其他傳統(tǒng)技術(shù)無法企及。在幾種高通量(二代)測序技術(shù)中，羅氏454測序技術(shù)和Illumina測序技術(shù)是目前應(yīng)用宏基因組學(xué)研究中應(yīng)用的主流。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，功能基因芯片將微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能緊密結(jié)合，與高通量測序技術(shù)相互補(bǔ)充， 可用于對病原微生物群落功能結(jié)構(gòu)和代謝功能的研究。

5.4 大力發(fā)展動物病原微生物宏基因組學(xué)的生物信息學(xué)

高通量測序和基因芯片等技術(shù)為病原微生物研究提供了極大的數(shù)據(jù)量，如何從這些海量數(shù)據(jù)中挖掘有效信息，成為宏基因組學(xué)研究的一大難題。特別是隨著高通量檢測技術(shù)成本不斷下降、通量逐漸提高、準(zhǔn)確度越來越有保障，生物信息學(xué)(bioinformatics)的發(fā)展將成為制約微生物研究的瓶頸[34]。最近，Deng等[35](2012)基于高通量數(shù)據(jù)成功構(gòu)建了分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)(molecular ecological networks， MENs)，該網(wǎng)絡(luò)可根據(jù)數(shù)據(jù)固有特性自動選擇閾值，可較好地反映環(huán)境中微生物之間的相關(guān)性，并且對高通量技術(shù)普遍存在的高噪音問題有很好的耐受性，因此大力發(fā)展動物病原微生物信息學(xué)及其網(wǎng)絡(luò)平臺是今后的重要任務(wù)之一。

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