HO-1不同活性真核表達載體的構建及鑒定

高 涵周 濤張春晶 李淑艷 陳宏月

1.齊齊哈爾醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科，黑龍江齊齊哈爾 161006

血紅素加氧酶（Heme Oxygenase,HO）有三種不同亞型：HO-1是誘導型血紅素氧化酶；HO-2是組成性表達；HO-3最近才被發(fā)現(xiàn)，功能不清。HO-1是Wise和他的同事們最先在體外實驗中發(fā)現(xiàn)的一種能降解血紅素的酶,命名為HO-1[1]?，F(xiàn)在人們已經(jīng)認識到HO-1是氧化應激、炎癥、免疫、細胞調(diào)節(jié)和信號轉導中一種重要的分子。近幾年對HO-1與腫瘤之間關系的研究越來越多，已經(jīng)成為HO-1研究里的一個新熱點[2]。從2013年12月—2014年7月為研究HO-1基因過表達后對腫瘤細胞生物學的影響，我們將HO-1基因克隆構建到真核表達載體上，并穩(wěn)定轉染到肝癌胞系HepG2中。為進一步研究HO-1與腫瘤發(fā)生機制作前期準備。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實驗所選用肝癌細胞系HepG2，質粒pcDNA3.1(+)，pCAAG，胎牛血清，1640培養(yǎng)基，LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑盒，限制性核酸內(nèi)切酶 （BamHⅠ/EcoRⅠ），質粒提取試劑盒，G418，小鼠抗HO-1抗體，兔抗β-actin抗體，HRP標記山羊抗小鼠二抗，HRP標記山羊抗兔二抗。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

根據(jù)HO-1基因序列設計一對引物：上游引物5ˊ-CCGGATC CTCCAGAGTTTCCGCATACAACC-3ˊ下游引物5ˊ-CGGAATTCAGAAAGGAAACACAGGGAGTGG-3ˊ。上下游引物分別引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。引物由美國Invitrogen公司合成。采用PCR技術擴增wtHO-1/mHO-1G143H基因片斷,EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后連接pcDNA3.1(+)載體與目的片段,轉化DH5a菌株感受細胞，獲得陽性重組質粒。采用脂質體法轉染HepG2細胞系，G418篩選抗性克隆,利用半定量RT-PCR、Western blot檢測轉染細胞系中HO-1基因的表達。選擇T7測序引物，由上海生工生物工程有限公司進行測序。用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度定量。

2 結果

2.1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H重組載體的鑒定

電泳圖譜見圖1可見，經(jīng)序列測定與Genbank中的HO-1cDNA（NM010443）序列進行比對，序列完全一致，突變體也和預期完全一致。證明重組載體構建成功。

圖1 pcDNA3.1(+)-wtHO-1/mHO-1G143H質粒雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳

2.2 轉染細胞外源性HO-1mRNA表達水平檢測

結果見圖2：穩(wěn)定轉染的6個HepG2細胞克隆可見目的條帶（長度為240bp）。圖3：穩(wěn)定轉染的4個HepG2細胞克隆中可見目的條帶（長度為1122bp）。

2.3 轉染細胞HO-1蛋白表達水平的檢測

結果如圖4所示，在分子量為32kDa附近檢測出目的條帶。說明實現(xiàn)了HO-1蛋白的過表達。

圖2 轉染細胞外源性HO-1mRNA表達水平

圖3 轉染細胞mHO-1G143HmRNA表達水平

圖4 Western blot檢測轉染細胞HO-1/HO-1(G143H)蛋白表達水平

3 討論

在以往的研究中對肝癌細胞的研究甚少，本實驗選取肝癌細胞系（HepG2）做為研究對象，由于脂質體對HepG2細胞的轉染效率高，能夠達到70%～80%,所以在本實驗中采用脂質體介導的方法進行轉染。我們的實驗選用的是pcDNA3.1(+)質粒載體，該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選，我們成功獲得了pcDNA3.1(+)-wtHO-1/pcDNA3.1(+)-mHO-1G143H基因穩(wěn)定轉染的HepG2細胞系，并應用于后續(xù)研究。目前HO-1與腫瘤之間的關系仍然不是十分清楚。在Goodman AI，Hirai K，Jun Fang等人的研究中發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤中能檢測到HO-1高表達，抑制HO-1的表達能夠抑制腫瘤的生長[3-4]；在Fang[5]等人的研究中提出HO-1的高表達具有抗氧化的作用，保護癌細胞；也有文章報導HO-1可以抑制腫瘤的生長，例如Hill[6]等人的研究中發(fā)現(xiàn)HO-1的表達可以抑制乳腺癌細胞的生長。HO-1的過表達與腫瘤的發(fā)展和預后存在一定聯(lián)系,但目前還沒有定論。在肝癌細胞中，HO-1也很可能可以轉入核內(nèi)通過蛋白質-蛋白質相互作用或蛋白質-DNA相互作用調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)控因子的表達，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HO-1具體是通過那些機制來調(diào)節(jié)腫瘤相關基因的表達將是我們進一步研究的重點。

[1]Wise CD,Drabkin DL.Degradation of haemoglobin and hemin tobiliverdin by a new cell-free ststemobtained from the hemophagous organ of dog placenta[J].Fed Proc,1964（23）:323.

[2]Sambrook J and RussellDW.Molecular Cloning-A Laboratory Namual3 Edition[M].Cold Spring Harbor Laboratory Press,Ney york,2011.

[3]Hirai K,Sasahira T,Ohmori H,et al.Inhibition of heme oxygenase-1 by zincprotoporphyrin IX reduces tumor growth of LL/2 lung cancer in C57BL mice[J].Int J Cancer，2007（120）:500-505.

[4]Fang J,Sawa T.H.In vivo antitumor activity of pegylated zinc protoporphyrin:targeted inhibition of heme oxygenase in solid tumo[J].Cancer Res，2010（63）:3567-3574.

[5]Hillm,Pereira V,Chauveau C,Zagani R,et al.Heme oxygenase-1 inhibits rat and human breast cancer cell proliferation:mutual cross inhibition with indoleamine 2,3-dioxygenase[J].FASEB J，2012（19）:1957-1968.

[6]Hirai H,Kubo H,Yamaya M,et al.Microsatellite polymorphism in heme oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to oxidantinduced apoptosis in lymphoblastoid cell lines[J].Blood，2011（102）:1619-1621.