常壓低氧小鼠氧耗量測定新裝置的研究及應(yīng)用*

段瑞峰，曾祥芝，紀(jì)佳麗，張志清，張雁芳，龍超良，劉 衛(wèi)，崔文玉，汪 海

在缺氧實(shí)驗(yàn)和抗心肌缺氧藥物篩選中常需要測定小鼠氧耗量。曹守義等建立了同時測定小鼠抗缺氧和耗氧量的簡便實(shí)驗(yàn)方法，該方法能夠觀察藥物延長小鼠存活時間的兩種作用：降低氧耗量和提高機(jī)體對缺氧的耐受力［1］。蔣志文等利用自制的數(shù)字可讀式小鼠氧耗檢測儀進(jìn)行小鼠整體氧耗的動態(tài)測定，通過對動物分鐘氧耗的連續(xù)讀數(shù)，實(shí)現(xiàn)了對于常壓環(huán)境中動物耗氧情況的動態(tài)觀察，表明它可以作為一種抗心肌缺血缺氧藥物篩選的有效方法［2］。但是小鼠氧耗量測定過程需要密切觀察及人工記錄與動物艙相連的長管中液體流動的距離來反映動物消耗的氧氣體積，人力投入多且不能長時間紀(jì)錄［1-3］。為了解決以上問題，本實(shí)驗(yàn)建立了一種小鼠氧耗量記錄方法，能夠同時紀(jì)錄多個小鼠的耗氧過程，觀測數(shù)據(jù)自動錄入電腦，實(shí)現(xiàn)了同時對多個動物氧耗量的動態(tài)觀察。利用該裝置觀察了急性重復(fù)低氧小鼠的氧耗量特征。

1 材料與方法

1.1 材料

550ml塑料瓶，儲水瓶，液位繼電器控制系統(tǒng)；水檢計(jì)，電子天平（EPS-2001，長沙湘平科技發(fā)展有限公司），天平數(shù)據(jù)輸出線，軟管，電腦，鈉石灰，計(jì)時器，生理鹽水。鈉石灰購自上海五四化學(xué)試劑有限公司；雄性昆明小鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)裝置由動物艙（內(nèi)放二氧化碳吸附劑鈉石灰）、儲水瓶、液位繼電器控制系統(tǒng)、水檢計(jì)、天平、天平數(shù)據(jù)輸出線、軟管、裝有記錄重量變化軟件的電腦等組成（圖1）。動物艙由550 ml兒童吸管水壺（Disney，廣州冠昕爾貿(mào)易有限公司）改裝而成。該水壺由四部分組成：蓋子、杯體、蓋子上面的一個小飲水杯（帶杯柄）、與杯體底部相扣的一個小水杯。將杯體底部用電烙鐵鉆多個小孔以和下部的小杯通氣并用膠水將下部的小杯和杯體粘緊密封，下部的小杯將用于儲存補(bǔ)償艙內(nèi)氣體壓力而進(jìn)入的水。去除上部小水杯的小杯柄并放入杯子中，在小水杯中放入鈉石灰后再將小鼠放入其中作為動物艙。在下部的小杯和杯體上各開一個小孔并分別連接進(jìn)水管和與水壓計(jì)連接的管子。用量水法測定動物艙和儲水小水杯的總體積為550ml。

工作原理簡述如下：動物艙（9）中由于動物（10）不斷吸入氧氣，產(chǎn)生的二氧化碳被動物艙（9）中的鈉石灰（11）吸收而使水檢壓計(jì)（7）水柱向動物艙內(nèi)部方向流動，全部浸入生理鹽水液面下的液位繼電器控制系統(tǒng)（6）的兩個電極（8）中較短的一個電極脫離液面使液位繼電器的電路觸發(fā)，接通控制自動進(jìn)氣裝置的進(jìn)氣閥門打開通過水管（5）向動物艙（9）供水；當(dāng)補(bǔ)償了動物消耗的氧氣的相同體積的水后動物艙內(nèi)氣壓將升高從而使水檢壓計(jì)（7）水柱向動物艙艙外方向流動，液位繼電器控制系統(tǒng)（7）的兩個電極（8）又全部浸入生理鹽水液面下，液位繼電器控制系統(tǒng)（7）關(guān)閉進(jìn)水閥門停止向動物艙供水；此過程周而復(fù)始從而實(shí)現(xiàn)動物艙（9）內(nèi)氣體壓力保持與動物艙（9）外大氣壓相同。動物艙和儲水小水杯間有氣孔（12）相通。

流入動物艙（9）的水是由放于天平（3）上的儲水瓶（4）進(jìn)行供給，其流失量將實(shí)時的通過天平數(shù)據(jù)輸出線（2）被安裝有重量變化記錄軟件的電腦（1）自動連續(xù)地記錄進(jìn)Microsoft Office Excel文檔中便于數(shù)據(jù)處理和作圖。

通過以上過程動物艙中動物的氧耗量及氧耗速率過程就可以自動連續(xù)的記錄進(jìn)Microsoft Office Excel文檔中。

記錄軟件為自編重量記錄軟件WeightRecorder v1.2.0，所使用的電子天平精度為 0.1 g，可以連續(xù)以一定時間間隔記錄數(shù)據(jù)，也可以只在進(jìn)水時儲水瓶重量有變化時記錄數(shù)據(jù)。電腦時間與當(dāng)時的儲水瓶重量記錄嚴(yán)格同步。本實(shí)驗(yàn)一臺電腦同時連接2臺記錄天平，從而可以同時記錄2套氧耗量測定裝置中的動物氧耗過程，本實(shí)驗(yàn)均以15 s的間隔連續(xù)記錄數(shù)據(jù)。

Fig.1 The sketch map of an oxygen consumption real-time recording device1：Computer；2：Balance data output line；3：Balance；4：Water reservoir；5：Water pipe；6：The liquid level relay control system；7：Watermanometer；8：Electrode；9：Animal cabin；10：Animal；11：Soda lime；12：Air hole

1.3 動物分組及飼養(yǎng)

急性重復(fù)低氧小鼠實(shí)驗(yàn)，選擇健康雄性昆明小鼠，按照體重相近兩兩配對，分為兩個組（n＝6）：對照組和處理組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

利用10ml注射器檢驗(yàn)儀器的精準(zhǔn)度。用注射器從動物艙抽氣體積分別為 1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml和6 ml，記錄進(jìn)入儲氧艙的補(bǔ)水量，對抽氣量（ml）和補(bǔ)水量（g）兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對 t檢驗(yàn)，評價(jià)裝置的準(zhǔn)確度。利用10 ml注射器抽1 ml氧氣6次，記錄進(jìn)入儲氧艙的補(bǔ)水量，計(jì)算補(bǔ)水量的平均值和方差及變異系數(shù)，評價(jià)裝置的精密度。

利用該裝置觀察了6只急性重復(fù)低氧小鼠和6只不低氧處理的正常對照小鼠的常壓密閉低氧過程的氧耗量特征。急性重復(fù)低氧小鼠放入含有新鮮空氣的動物艙內(nèi)，瓶內(nèi)盛有10 g鈉石灰（用以吸收二氧化碳和水），旋緊瓶蓋后計(jì)時，35 min后立即將小鼠取出，并隨即轉(zhuǎn)移到另一相同容積、含有新鮮空氣的動物艙內(nèi)密閉，如此重復(fù)3次，第四次旋緊瓶蓋后開始計(jì)時，以小鼠停止呼吸為死亡指標(biāo)，記錄存活時間。用本實(shí)驗(yàn)裝置記錄氧耗過程，按照15 s的間隔記錄儲水瓶重量到Microsoft Office Excel文檔。正常對照組小鼠在急性重復(fù)低氧小鼠第四次開始計(jì)時同步測定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。儀器精度檢驗(yàn)數(shù)據(jù)采用兩組數(shù)據(jù)成對 t檢驗(yàn)，兩組動物的氧耗量數(shù)據(jù)比較采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 氧耗量測定裝置準(zhǔn)確度和精密度檢測

用注射器從動物艙抽氣體積分別為1 ml、2 ml、3ml、4ml、5ml和 6ml，進(jìn)入儲氧艙的補(bǔ)水量分別相當(dāng)于氣體體積為 1ml、1.9ml、3 ml、4 ml、5ml和 6.1 ml，兩組數(shù)據(jù)配對 t檢驗(yàn)P＝1，說明裝置的測量數(shù)值準(zhǔn)確度較高。利用10ml注射器從動物艙抽1 ml氣體6次，進(jìn)入儲氧艙的補(bǔ)水量分別相當(dāng)于氣體體積為 1ml、1.1 ml、1 ml、1 ml、1 ml和 1 ml，ˉx±s為1.01±0.04，變異系數(shù)為 0.04，說明裝置測量數(shù)據(jù)精密度較高。

2.2 急性重復(fù)低氧處理組及對照組小鼠的存活時間和總耗氧量

處理組及對照組小鼠的體重、存活時間和總耗氧量數(shù)據(jù)見表1。處理組小鼠的存活時間為（58.8±6.8）min，顯著高于對照組（46.0±8.7）min（P＜0.05）。處理組小鼠的總氧耗量為（85.1±8.5）ml，顯著高于對照組（73.6±5.4）ml（P＜0.05）。

Tab.1 Effectofacute repetitive hypoxia on survival time and oxygen consumption（ˉx±s，n＝6）

3 討論

小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)是抗缺氧藥物評價(jià)中常用的一種方法。不斷開發(fā)相關(guān)裝置來實(shí)現(xiàn)同時測定小鼠抗缺氧和耗氧量指標(biāo)以發(fā)現(xiàn)更詳細(xì)的藥理作用機(jī)制，其中以動物艙連接補(bǔ)水裝置進(jìn)行氣液聯(lián)動實(shí)現(xiàn)動物艙氣壓恒定法最為簡單實(shí)用［1-3］。但是這些方法在補(bǔ)水量的監(jiān)測上大多利用水通過一定長度直徑恒定的細(xì)管的長度來計(jì)算，費(fèi)力而且儀器允許檢測的時間短（低于30 min），這樣就不容易實(shí)現(xiàn)同時對多個動物氧耗量的檢測，實(shí)現(xiàn)補(bǔ)水量的自動監(jiān)測、記錄及同時檢測多個動物氧耗量的功能將提高實(shí)驗(yàn)效率，節(jié)省人力。本文制作了一種小鼠氧耗量動態(tài)變化實(shí)時監(jiān)測和記錄裝置，可以將檢測數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入Excel中進(jìn)行作圖計(jì)算。本裝置可以同時檢測多個小鼠的氧耗量，儀器允許檢測的時間長。實(shí)驗(yàn)表明裝置檢測的準(zhǔn)確性和精度高，為小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)提供了一種比較理想的實(shí)驗(yàn)工具。

急性重復(fù)缺氧是一種多次急性缺氧-復(fù)氧的過程。研究急性重復(fù)缺氧對于臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動醫(yī)學(xué)及航天醫(yī)學(xué)均有理論和實(shí)際意義［4，5］。本研究結(jié)果表明，小鼠在含有520ml空氣（含104ml O2）的密閉瓶中35 min后會因缺氧而煩躁不安，但無動物死亡，因此本實(shí)驗(yàn)采用將小鼠在密閉瓶中放置35 min的方法進(jìn)行低氧處理。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過3次各35 min急性重復(fù)低氧處理的小鼠與對照組小鼠相比存活時間顯著延長，其總氧耗量也顯著增加，這說明3次急性重復(fù)低氧預(yù)處理提高了動物從密閉動物艙中攝取氧氣的能力從而存活時間延長。

從本裝置的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文使用的常壓缺氧小鼠氧耗量測定裝置準(zhǔn)確性和精密度均較高，可用于低氧研究中動物氧耗量的測定。

［1］ 曹守儀，李寶華.同時測定小鼠抗缺氧和耗氧量的簡便實(shí)驗(yàn)方法［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1995，11（1）：85-86.

［2］ 蔣志文，徐淑秀，吳克余，等.小鼠整體氧耗的動態(tài)測定［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1996，12（6）：567-569.

［3］ 蔣志文，徐淑秀，吳克余，等.常壓密閉條件下小鼠的氧耗特征［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，21（4）：213-214.

［4］ 呂國蔚主編.缺氧預(yù)適應(yīng)：一種缺氧防治的新理念與新策略［M］.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2005.

［5］ Lu GW，Cui XY，Zhao BM.Alteration of oxygen consumption and energymetabolism during repetitive exposure ofmice to hypoxia［J］.Neurochem Res，1999，24（5）：625-628.