姜黃素對自發(fā)性高血壓大鼠腦缺血／再灌注后海馬神經(jīng)元損傷及RANTES表達的影響*

俞陳陳，胡 涵，汪小丹，曹 紅，姬 斌，李 軍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325027）

高血壓是引起缺血性腦病的主要危險因素，缺血性腦病是危害人類健康的三大疾病之一，而溶栓之后可引起嚴重的再灌注損傷。有研究表明，調(diào)解活化正常T細胞表達和分泌的趨化因子（regulatedupon activation normal T-cell expressed and secreted，RANTES）是介導(dǎo)腦缺血／再灌注損傷炎癥反應(yīng)的重要因素之一［1］。目前靜脈用組織纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA）是美國FDA唯一批準用于治療急性缺血性腦卒中的藥物，tPA在腦卒中發(fā)生3 h內(nèi)給予發(fā)揮最佳效果，僅有4%的腦缺血患者受益于此［2］。姜黃素是由姜黃中提取的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種生物學(xué)作用。有研究表明，姜黃素可通過抑制RANTES表達減輕星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的急性脊髓損傷，姜黃素的抗炎效應(yīng)可用于治療各種神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病，包括急性脊髓損傷后的創(chuàng)傷性炎癥［3］。本研究探討自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）在全腦缺血／再灌注后海馬神經(jīng)元損傷和RANTES在海馬CA1區(qū)的動態(tài)變化，及姜黃素對SHR缺血性神經(jīng)元損傷的保護作用與抑制RANTES蛋白表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

HE染色盒購自北京索萊寶科技有限公司，Nissl染色盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，大鼠趨化因子（RANTES）ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，姜黃素購自美國Sigma公司，用玉米油配置成20mg／ml貯存液，避光于 4℃冰箱保存，Olympus Cx21倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，Multiskan Mk3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 動物分組

與雄性WKY大鼠同源的 SHR 90只和雄性WKY大鼠60只，SPF級，8周齡，體重（180～200）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（許可證編號：SCXK（京）2012-0001）提供，在 22～25℃實驗室中飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)實驗室環(huán)境。SH標準：安靜狀態(tài)下尾動脈收縮壓＞160 mmHg。采用隨機數(shù)字表法，將WKY大鼠隨機分為2組（n＝30）：假手術(shù)組（WSham組）、缺血／再灌注組（W-I／R組），將 SHR隨機分為3組（n＝30）：假手術(shù)組（S-Sham組）、缺血／再灌注組（S-I／R組）、姜黃素組（S-Cur組）。以上各組再根據(jù)再灌注時間，分為 3 h、12 h、1 d、3 d和 7 d五個亞組。各組處理：W-Sham組和S-Sham組僅分離雙側(cè)頸總動脈但不夾閉；S-Cur組于再灌注30min時腹腔注射姜黃素100mg／kg（本課題組前期實驗結(jié)果表明，100mg／kg劑量的保護作用優(yōu)于 30 mg／kg和300mg／kg）：其他組別于再灌注30 min時腹腔注射等容積玉米油。

1.3 模型制備

大鼠全腦缺血／再灌注模型的制備參照文獻［4］介紹的四血管阻斷法制備全腦缺血／再灌注模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg／kg麻醉下，雙極電凝器電凝雙側(cè)椎動脈，并分離雙側(cè)頸總動脈，穿線備用，24 h后于清醒狀態(tài)下應(yīng)用無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈（阻斷椎動脈后若即刻夾閉雙側(cè)頸動脈實施缺血／再灌注，大鼠死亡率高，模型成功率非常低），使全腦缺血10 min，然后恢復(fù)灌注。腦缺血時維持大鼠直腸溫36.5～37.5℃。以缺血動物60 s內(nèi)發(fā)生翻正反射消失、四肢僵直、眼球蒼白、瞳孔散大等為腦缺血成功的標準，不合標準者剔除。

1.4 行為學(xué)觀察

再灌注后7 d用跳臺試驗觀察大鼠學(xué)習記憶能力。跳臺裝置為30 cm×30 cm×40 cm的被動回避反應(yīng)箱，箱底鋪直徑1 mm銅柵，通36 V交流電，箱壁由黑色塑料板圍成，銅柵的一角固定5 cm×5 cm×5 cm大小的塑料泡沫塊作為動物回避電擊反應(yīng)的安全區(qū)。先將大鼠放入箱中訓(xùn)練5min，并記錄首次找到安全區(qū)所需的時間（反應(yīng)時間）和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)（錯誤次數(shù)），作為學(xué)習成績。24 h后重復(fù)上述實驗，記錄第1次跳下安全區(qū)的時間（潛伏期）和錯誤次數(shù)，作為記憶成績。實驗在安靜房間內(nèi)進行。整個實驗過程中保持室內(nèi)燈光等周圍環(huán)境條件的一致。所有行為學(xué)觀察由同一組實驗員完成。

1.5 組織學(xué)切片

于再灌注 3 h、12 h、1 d、3 d和 7 d時將大鼠麻醉，開胸經(jīng)升主動脈插管，依次灌注生理鹽水150 ml和4%多聚甲醛溶液150 ml，斷頭取腦，在視交叉后1mm和4mm處冠狀面切開，取中間腦組織置于同一多聚甲醛溶液中固定1 d，再置于10%福爾馬林溶液中固定1 d，石蠟包埋。在大鼠腦冠狀切面海馬水平連續(xù)冠狀切片，片厚4μm。

1.6 HE染色觀察錐體細胞形態(tài)

切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素初染，伊紅復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片，觀察海馬CA1區(qū)錐體細胞的形態(tài)。

1.7 Nissl染色計數(shù)平均錐體細胞密度

切片常規(guī)脫蠟至水，甲苯胺藍染色，脫水、透明、中性樹膠封片，高倍鏡下計數(shù)海馬CAl區(qū)每mm區(qū)段內(nèi)正常錐體細胞數(shù)目（胞膜皺縮、尼氏體消失者剔除），即錐體細胞密度。雙側(cè)海馬錐體細胞密度取平均值為平均錐體細胞密度［5］。各組平均錐體細胞密度以均數(shù) ±標準差（ˉx±s）表示。

1.8 ELISA法測定海馬RANTES蛋白表達水平

于再灌注3 h、12 h、1 d、3 d和 7 d時取 3只大鼠，斷頭取腦，快速分離海馬，加適量細胞裂解液進行低溫勻漿，提取總蛋白并根據(jù)BCA法測定樣本蛋白濃度后備用。采用ELISA法測定RANTES濃度，按照RANTES-ELISA試劑盒說明書進行測定。采用酶標儀測定450 nm處吸光度值，根據(jù)標準曲線計算實際濃度。根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織的總蛋白濃度計算出單位質(zhì)量海馬組織中RANTES的質(zhì)量，以pg／mg表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量數(shù)據(jù)均以均值±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)差異采用隨機區(qū)組資料設(shè)計。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對大鼠行為學(xué)的影響

W-Sham組和S-Sham組大鼠學(xué)習、記憶成績無差別。S-I／R組大鼠學(xué)習成績和記憶成績較W-I／R組有顯著下降（P＜0.05）。缺血／再灌注后，S-I／R組大鼠學(xué)習成績和記憶成績較S-Sham組大鼠明顯下降（P＜0.05）。S-Cur組大鼠學(xué)習成績和記憶成績與 S-I／R組大鼠比較有所改善（P＜0.05，表 1）。

2.2 姜黃素對海馬錐體細胞形態(tài)的影響

光鏡下可見W-Sham組和S-Sham組大鼠海馬各區(qū)錐體細胞排列整齊、密集，胞體呈錐體形，邊界清楚；細胞核大，呈圓形或橢圓形，核膜清晰，核仁明顯。W-I／R組和S-I／R組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列稀疏，胞質(zhì)嗜伊紅染，核固縮深染，S-I／R組損傷更嚴重。再灌注后1 d、3 d、7 d海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)目減少，排列散亂，凋亡小體形成，部分細胞核呈碎片狀。S-Cur各組大鼠錐體細胞輪廓尚清，核形狀規(guī)則（圖1見彩圖頁Ⅱ）。

Tab.1 Comparison of learning andmemory ability among different groups（ˉx±s，n＝6）

2.3 姜黃素對海馬錐體細胞密度的影響

與W-Sham組大鼠比較，W-I／R組大鼠于再灌注后1 d，3 d，7 d時間點海馬CA1區(qū)錐體細胞密度減少（P＜0.05）；與 S-Sham組大鼠比較，S-I／R組大鼠于再灌注后12 h，1 d，3 d，7 d時間點海馬 CA1區(qū)錐體細胞密度減少（P＜0.05）；S-Sham組和 S-Cur組大鼠錐體細胞密度無差別；與S-I／R組大鼠比較，SCur組大鼠于再灌注后1 d，3 d，7d時間點海馬CA1區(qū)錐體細胞密度增加（P＜0.05，表 2）。

2.4 姜黃素對海馬RANTES表達的影響

與W-Sham組大鼠比較，W-I／R組大鼠于再灌注后12 h，1 d時間點海馬RANTES蛋白表達上調(diào)（P＜0.05，表3），S-Sham組大鼠再灌注后海馬 RANTES蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與 W-I／R組和S-Sham組大鼠比較，S-I／R組大鼠分別于再灌注后3 h，12 h，1 d和 3 h，12 h，1 d，3 d，7 d時間點海馬RANTES蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）；與 S-I／R組大鼠比較，S-Cur組大鼠于再灌注后 12 h，1 d，3 d，7 d時間點海馬 RANTES蛋白表達下調(diào)（P＜0.05）；S-I／R組大鼠海馬RANTES蛋白在再灌注后3 h可見表達升高，于1 d達高峰，隨后逐漸下降至7 d。

Tab.2 Comparison of density of vertebral cell in hippocampal CA1 region at different time pointafter reperfusion（cells／mm，ˉx±s，n＝3）

Tab.3 Comparison of expression of RANTES in hippocampal of different group at different time point after reperfusion（pg／mg，ˉx±s，n＝3）

3 討論

本實驗采用全腦缺血／再灌注（I／R）模型，研究各組WKY大鼠、SHR在各再灌注時間點海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷和RANTES表達的變化及再灌注后7 d學(xué)習、記憶能力。WKY大鼠和SHR在腦I／R后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷加重，RANTES蛋白表達上調(diào)，再灌注后7 d學(xué)習和記憶能力下降。與WKY大鼠相比，SHR在腦I／R后海馬CA1區(qū)錐體細胞損傷加重，RANTES蛋白表達上調(diào)，再灌注后7 d學(xué)習和記憶能力下降。本實驗表明再灌注后30 min腹腔注射100mg／kg姜黃素能減輕I／R后SHR海馬CA1區(qū)椎體細胞損傷，抑制RANTES蛋白表達，改善學(xué)習和記憶能力。但本研究結(jié)果為該課題組的初步成果，有待以后增加樣品量進行深入研究。

高血壓是一種慢性炎癥反應(yīng)［6］。在高血壓的情況下，血管周圍脂肪組織RANTES蛋白表達上調(diào)［7］。在長期高血壓的情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能會發(fā)生改變［8］。自發(fā)性高血壓大鼠隨著年齡增長，海馬CA1區(qū)和齒狀回區(qū)容積及神經(jīng)元數(shù)目逐漸減少，星形膠質(zhì)細胞逐漸增多［9］。我們前期研究表明自發(fā)性高血壓大鼠腦I／R后海馬CA1區(qū)損傷程度明顯重于正常血壓大鼠，學(xué)習和記憶能力也顯著下降［10-11］。RANTES是趨化因子CC亞家族中的一員，由91個氨基酸組成，CCR5屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，是RANTES的受體。RANTES介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是引起腦I／R神經(jīng)元損傷的機制之一［1］。缺血缺氧、應(yīng)激、創(chuàng)傷等都可引起腦缺血損傷，使小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生神經(jīng)毒性物質(zhì)氧化亞氮、自由基和各種細胞因子（IL-1、IL-6和 TNF-α等），激活星形膠質(zhì)細胞表達RANTES，RANTES與炎癥細胞（白細胞、巨噬細胞等）表面 CCR5結(jié)合，通過激活 PI-3K而使 Akt／PKB表達，使炎癥細胞粘附并趨化，RANTES與CCR5結(jié)合還可促使細胞內(nèi)鈣離子釋放并與DAG結(jié)合，激活ERK1／2表達引起炎癥細胞增殖，加重腦損傷［12，13］。Terao等［1］研究表明，RANTES基因敲除小鼠大腦中動脈 I／R模型中，IL-6、IL-10和IL-12表達減少，腦梗死面積縮小，血腦屏障功能得到改善。本實驗表明，WKY大鼠和 SHR在腦 I／R后海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元損傷加重，RANTES蛋白表達上調(diào)，再灌注后7 d學(xué)習和記憶能力下降，提示RANTES可能參與腦I／R損傷。與WKY大鼠相比，SHR全腦I／R后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷增加，RANTES蛋白表達上調(diào)，提示高血壓情況下可能更易發(fā)生RANTES介導(dǎo)的腦缺血性損傷。

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，對姜黃素的分子藥理學(xué)研究表明，姜黃素具有多方面藥理作用，如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等作用。姜黃素可減少腎缺血損傷時RANTES蛋白的過度表達［14］，也可明顯抑制急性脊髓損傷時星形膠質(zhì)細胞 RANTES表達［3］。曹紅［15］等人研究表明，姜黃素可顯著減少沙土鼠I／R后海馬CA1區(qū)凋亡錐體細胞數(shù)量，誘導(dǎo)Fos蛋白及抑制NF-kB蛋白的表達。前期研究表明姜黃素可通過凋亡通路抑制海馬c-jun、c-fos和JNK3等蛋白表達減輕 SHR腦 I／R損傷［10，16］。姜黃素是否能通過抑制SHR腦I／R損傷炎癥反應(yīng)影響海馬RANTES的表達鮮有報道。本實驗發(fā)現(xiàn)，給予100 mg／kg姜黃素能顯著減少I／R后SHR海馬CA1區(qū)損傷的神經(jīng)元，同時明顯抑制RANTES的表達。提示姜黃素可能通過抑制RANTES的表達，對SHR腦I／R損傷發(fā)揮神經(jīng)保護效應(yīng)。

綜上所述，I／R更易導(dǎo)致SHR海馬神經(jīng)元損傷。姜黃素減輕SHR腦I／R海馬神經(jīng)元損傷，其機制可能與抑制RANTES蛋白的表達有關(guān)。

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