大鼠胰腺星狀細胞分離培養(yǎng)與鑒定

崔立華，張淑坤，崔乃強，夏亞飛，許大輝

1.天津市中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所（天津300100）

2.天津市南開醫(yī)院肝膽胰外科（天津300100）

3.天津市南開醫(yī)院藥學(xué)科（天津300100）

纖維化是慢性胰腺炎的典型病理特征，活化的胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cell，PSC）是胰腺纖維化的主要效應(yīng)細胞。PSC分離和成功培養(yǎng)是體外研究胰腺纖維化的重要前提。未活性化的PSC胞漿中富含維A脂滴，并表達desmin蛋白，活化后的PSC則表達α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）[1]。目前國內(nèi)PSC的分離方法主要以組織塊法為主[2-3]，我們參照Apte方法[4]并加以改動，酶消化后通過Nycodenz密度梯度離心成功分離出PSC，為開展胰腺纖維化研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量300～350 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所。鏈蛋白酶、DNase I、GBSS（Gey’s balanced salt solution）、兔抗大鼠α-SMA抗體、多聚賴氨酸均購自Sigma公司。兔抗大鼠desmin抗體購自Cell Signaling公司。膠原酶P購自Roche公司。Nycodenz購自Axis-Shield公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司。SP試劑盒購自武漢BOSTER公司。油紅O購自上海Solarbio公司。CO2細胞培養(yǎng)箱來自上海力康公司Heal Force。冷凍離心機來自湘儀H2050R。

1.2 方法

1.2.1 PSC分離與培養(yǎng) 采用體質(zhì)量300 g左右雄性Wistar大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，備皮，消毒。沿腹部正中線開腹，沿十二指腸無菌取出胰腺。PBS洗滌2次，將胰腺剪碎成1～2 mm3的小塊，用含0.02%鏈蛋白酶，0.05%膠原酶P，0.1%DNase I的GBSS消化液37℃水浴消化20 min，消化后細胞懸液100μm濾網(wǎng)過濾，DMEM培養(yǎng)基洗滌，細胞重懸于9.5 mL含5%FBS的GBSS中，與8 mL 28.7%Nycodenz溶液混勻。輕輕加入6 mL含5%FBS的GBSS制成Nycodenz梯度，于4℃1400 g離心20 min，在Nycodenz與GBSS液面間的白色絮狀的模糊帶即為PSC。吸取細胞并用DMEM培養(yǎng)基洗2次，用含20%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)細胞成活率。將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，第2 d換液成含10%FBS的培養(yǎng)基，以后隔天換液。

1.2.2 油紅O染色 細胞棄去培養(yǎng)基后用PBS洗2次，加入4 mL 4%的中性甲醛固定30 min，水洗，60%的異丙醇浸洗，棄掉異丙醇，加入2 mL油紅O工作液。在室溫下孵育10 min，Mayer蘇木精染核1 min，充分洗滌后顯微鏡下拍照。

1.2.3 免疫細胞化學(xué)染色 接種合適的密度進行細胞固定，加入10%的山羊血清進行封閉。分別加入1∶200稀釋兔抗大鼠desmin一抗，單克隆α-SMA一抗，4℃過夜（PBS代替一抗作陰性對照）。加入IgG-HRP作用30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。以細胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽性細胞。

1.2.4 細胞生長曲線 采用第一代的PSC進行接種，細胞消化后用血球計數(shù)板進行計數(shù)以20 000個細胞/孔接種于6孔板。連續(xù)6 d進行細胞計數(shù)，每天對3個孔進行計數(shù)，每個孔計數(shù)4次，并取平均值，繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 新鮮分離的PSC成活率達90%，每只大鼠胰腺組織獲得活細胞約為8×105個。剛分離出的PSC呈圓形，胞質(zhì)透亮，胞核較大且明顯。接種24 h后大多數(shù)細胞已經(jīng)貼壁，細胞暈明顯，部分細胞伸出突起呈單角狀外觀，高倍鏡下可見胞漿中有脂滴樣結(jié)構(gòu)。48 h后，大多數(shù)細胞呈角狀外觀，胞漿飽滿。培養(yǎng)4～5 d后細胞約80%融合，可以進行傳代培養(yǎng)。第2、3代細胞呈多角狀生長，細胞核明顯，胞漿中可見明顯纖維絲結(jié)構(gòu)。當(dāng)細胞傳至第4、5代，胞質(zhì)核比顯著增大，細胞生長速度緩慢，立體感變差（圖1）。

圖1 體外培養(yǎng)PSC形態(tài)學(xué)觀察

2.2 油紅O染色 細胞在24 h，48 h，72 h均可在99%以上的細胞胞漿中看到幾個到十幾個明顯的紅色至橙紅色顆粒，呈串珠狀，說明細胞中脂滴含量豐富，直到培養(yǎng)第6 d胞漿中仍有少量的橙紅色顆粒，傳代后脂滴消失(圖2)。

圖2 油紅O染色（×400）

2.3 免疫細胞化學(xué) 培養(yǎng)的原代PSC細胞desmin免疫細胞化學(xué)染色觀察，24 h大多數(shù)細胞可見胞質(zhì)染成棕褐色，desmin表達陽性，培養(yǎng)48 h后desmin表達顯著減弱，傳代后基本不表達desmin。培養(yǎng)的原代PSC細胞α-SMA免疫細胞化學(xué)染色觀察，24 h大多數(shù)細胞基本不表達α-SMA，培養(yǎng)48 h后多數(shù)細胞α-SMA表達陽性，傳代后α-SMA陽性表達率接近100%(圖3)。

圖3 PSC免疫細胞化學(xué)染色（×400）

2.4 生長曲線 細胞接種后第1 d數(shù)量稍有下降，第2 d進入緩慢增長階段，之后細胞數(shù)量增加明顯，進入快速增長期。第5 d后細胞數(shù)量增加變慢，逐步進入平臺生長期（圖4）。

圖4 PSC細胞生長曲線

3 討論

PSC的細胞形態(tài)與肝星狀細胞高度相似[5]。正常胰腺組織中PSC大約占所有胰腺細胞總數(shù)的3.99%[6]，如何得到純度好、活力高的大量的PSC是一個關(guān)鍵問題。目前，PSC分離方法主要有組織塊培養(yǎng)法和酶消化法兩種，組織塊法操作簡便，但獲得的細胞純度和數(shù)量有限，長出的細胞為成纖維樣與活化后的細胞無法鑒別。酶消化的方式有逆行膽胰管注射，胸主動脈插管法和直接酶消化法等[7-8]，前兩種消化法消化的更充分，但操作技術(shù)難度大，需要大量的消化酶。直接酶消化法操作簡單，通過消化時間控制消化程度。梯度離心劑的選擇也各有不同，分別利用Nycodenz、Dextran和Percoll密度梯度離心方法分離了PSC，但報道的細胞產(chǎn)率和純度不一[9-10]，Nycodenz對細胞的毒性更小，梯度離心劑的制備更簡單。所以，我們采用直接酶消化法結(jié)合Nycodenz密度梯度離心，以期建立純度高、重復(fù)性好的PSC分離培養(yǎng)方法。

密度梯度離心法分離PSC主要有兩個步驟，酶消化和梯度離心。實驗中要快速切取胰腺組織，避免組織自溶。消化過程要保持液體緩慢搖動，控制好消化時間。取出的細胞懸液要加入血清終止消化，避免長時間消化造成的細胞損傷。消化過程主要是采用膠原酶P、鏈蛋白酶和DNase I聯(lián)合消化以獲得PSC。膠原酶P對胰腺間質(zhì)的消化較胰蛋白酶作用強,對細胞損傷較輕。鏈蛋白酶用于破壞胰腺上皮細胞，減少實質(zhì)細胞對PSC的黏附。DNase I可以減輕腺泡細胞破壞后釋放DNA所造成的細胞黏附聚集現(xiàn)象，這樣大大提高了細胞產(chǎn)率與純度。PSC富含脂滴,其平均密度在所有胰腺細胞中最低，位于Nycodenz與GBSS液之間的模糊帶，吸取過程要小心謹慎，盡量不要吸取多余的液體防止腺泡等細胞的污染。

PSC具有靜息態(tài)與激活態(tài)兩種，并分別具有特異的標志物。靜息狀態(tài)PSC胞質(zhì)內(nèi)富含的維生素A脂滴可以被油紅O染成紅色，陽性表達desmin。激活態(tài)PSC陽性表達α-SMA。油紅O染色發(fā)現(xiàn)，原代分離的細胞培養(yǎng)6 d，胞漿中仍可見明顯的脂滴，傳代后，橙紅色的脂滴顆粒顯著減少甚至消失。免疫細胞化學(xué)染色顯示，細胞接種24 h仍然表達desmin，48 h后desmin基本不再表達。培養(yǎng)48 h后絕大多數(shù)細胞開始表達α-SMA，隨著培養(yǎng)時間的增長和傳代次數(shù)的增加，細胞表達α-SMA，而不再表達desmin，說明細胞活化。提示PSC接種24 h后即啟動了激活過程，至培養(yǎng)第6 d大多數(shù)細胞激活，傳代后細胞處于高度激活狀態(tài)。

從細胞的生長曲線可以看出，細胞接種第1 d數(shù)量稍有下降，可能受貼壁情況的影響，因此細胞接種過程中要盡量快速、均勻，最大限度保持細胞的活力。接種3～5 d是細胞快速增殖的階段，細胞的活力最好，相關(guān)細胞實驗在此階段進行，能真實、客觀的反應(yīng)細胞的狀態(tài)。

相比較組織塊法的分離方法，密度梯度離心通過細胞密度差異選擇性的獲得細胞的純度較高。為了獲得高活力的PSC，要嚴格控制酶消化的時間及酶的濃度，盡量縮短整個實驗操作的時間。本實驗中接種原代細胞的培養(yǎng)瓶經(jīng)過0.1 mg/mL多聚賴氨酸處理，大大提高細胞貼壁率。本實驗通過膠原酶、鏈蛋白酶聯(lián)合法直接消化組織塊，然后通過Nycodenz梯度離心分離大鼠PSC,細胞成活率達90%以上，每只大鼠胰腺組織獲得活細胞約為8×105個，比插管注射消化法獲得的細胞略少，但能滿足實驗需要?？梢?，此方法重復(fù)性好、細胞純度高,為體外研究胰腺纖維化的機制提供了有力保障。

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