電針對缺血性腦卒中再灌注損害大鼠CREB表達的影響

楊珊莉江一靜陶 靜陳立典

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福州，350001；2福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州，350108）

電針對缺血性腦卒中再灌注損害大鼠CREB表達的影響

楊珊莉1江一靜2陶 靜1陳立典2

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福州，350001；2福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州，350108）

目的：探尋電針對缺血性腦卒中再灌注損害大鼠cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白（cAMP-response Element Binding Protein，CREB）表達的影響。方法：將60只健康成年的SD大鼠馴養(yǎng)3 d隨機分成假手術(shù)組、模型組以及電針組，每組各20只，使用線栓法大腦中動脈閉塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）對模型組、電針組大鼠進行腦缺血模型制作，缺血2 h后進行再灌注，電針組大鼠接受電針干預(yù)，再灌注3 d后將大鼠斷頭取腦，進行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色以及圖像軟件分析觀察腦梗死體積，免疫蛋白印跡法（Western blotting）檢測CREB蛋白水平，聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，PCR）檢測CREB的基因表達水平。結(jié)果：TTC及其圖像軟件分析表明，電針組的SD大鼠腦梗死面積明顯小于模型組（P＜0.01）；電針組的SD大鼠CREB蛋白水平明顯高于模型組（P＜0.01）；電針組的SD大鼠CREB基因水平明顯高于模型組（P＜0.01）。結(jié)論：電針改善腦缺血再灌注損傷可以通過上調(diào)CREB實現(xiàn)。

腦缺血；再灌注損傷；電針；cAMP反應(yīng)原件結(jié)合蛋白

腦卒中是一組突然起病，以局灶性神經(jīng)功能缺失為共同特征的急性腦血管疾病，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高及復(fù)發(fā)率高等特點，是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康與生命的主要疾病，2004年世界衛(wèi)生組織報告[1]指出全球每年約有1 500萬新發(fā)腦卒中患者，約500萬患者發(fā)病后死亡。2011年“世界卒中日”最新調(diào)查結(jié)果顯示，我國腦卒中的發(fā)病率以每年9%的速度上升，已經(jīng)成為我國國民第一位死亡原因，死亡率高于歐美國家4～5倍[2]。腦卒中中最常見的是缺血性腦卒中，其發(fā)病率占腦卒中的85%以上，常造成人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)細(xì)胞缺失和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)受損，導(dǎo)致患者長期神經(jīng)功能障礙[3]。缺血所導(dǎo)致的組織受損是臨床上死亡的主要原因之一。在缺血性疾病的急救過程中臨床工作者逐漸發(fā)現(xiàn)，缺血本身對組織造成的損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于恢復(fù)血供后過量的自由基攻擊缺血組織細(xì)胞所造成的“組織缺血再灌注損傷”。缺血性組織恢復(fù)血供后活性氧自由基水平上調(diào)，組織經(jīng)過缺血后合成抗氧化酶能力下降，過氧化物被轉(zhuǎn)換為無害的物質(zhì)的過程障礙，導(dǎo)致過氧化物在體內(nèi)堆積而加劇了對缺血后再灌注組織的損傷。目前治療腦卒中后肢體功能障礙的方法多種多樣，其中電針療法在治療缺血性腦血管病已被認(rèn)為是行之有效的方法之一，且不存在血腦屏障的問題。但其具體機制仍處于不斷的探索中。本課題立足于探索電針改善缺血性腦卒中肢體運動狀態(tài)的機理，以豐富中醫(yī)針刺治療腦卒中的理論基礎(chǔ)，為同類研究提供可靠的理論依據(jù)。筆者通過對60只成年SD進行造模干預(yù)觀察，探尋電針對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護機理，報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物及其分組 60只健康成年清潔級SD大鼠，體重220～280 g，平均（250±30）g，鼠齡2.5～4個月，平均（2±0.2）月。大鼠全由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。60只大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、電針組，每組各20只，3組大鼠在體重、鼠齡等一般情況方面無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。

1.2 模型制作 參照改良的Zea Longa[4]方法制備大鼠MCAO模型。首先使用10%水合氯醛按照0.3 m L／kg的劑量對大鼠進行腹腔注射麻醉，隨之將處于麻醉狀態(tài)的大鼠固定于手術(shù)臺，剔除大鼠頸部皮毛，與頸部正中切開長約3 cm的切口，將左側(cè)頸總動脈（Common Carotid Arteries，CCA）充分暴露，逐步剝離迷走神經(jīng)，將頸外動脈（External Carotid Artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（Internal Carotid Artery，ICA）充分剝離暴露，將CCA遠(yuǎn)心端充分結(jié)扎，用動脈夾夾閉ICA近分叉口處，同時將ECA近分叉口處充分結(jié)扎，在CCA近動脈分叉用顯微剪剪切一小口，用硅化魚線（d＝0.26 mm，魚線的2.0 mm及2.5 mm處各用記號筆作標(biāo)記）插入切口。松掉ICA的血管夾后魚線緩慢向頸內(nèi)動脈插入，可見第一個標(biāo)記距動脈分叉約2 mm時停止，用縫合線將CCA和魚線栓緊，縫好后用酒精棉球消毒皮膚縫合處。2 h后將魚線拔出2 cm長度，形成再灌注模型。假手術(shù)組大鼠只切開皮膚剝離頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總、頸外動脈后即縫合皮膚，縫好后用酒精棉球消毒皮膚縫合處。

1.3 治療方法 3組SD大鼠置于相同環(huán)境飼養(yǎng)，假手術(shù)組、模型組大鼠造模成功后第1天，開始模擬捉拿、電針，用直徑40 mm華佗針牌針具點觸穴位，每日1次，連續(xù)治療3 d；電針組參照李忠仁主編的《實驗針灸學(xué)》常用實驗動物針灸穴位取穴，對大鼠右側(cè)合谷、外關(guān)、陽陵泉、足三里進行針刺，針刺深度上肢4～6 mm，下肢6～8 mm，連接刺激電極后對大鼠進行疏密波（疏波／密波＝10 Hz，Hz／5 s，10 s）的刺激，以大鼠針刺肢體出現(xiàn)節(jié)律的收縮、顫動為度，持續(xù)30min，每日1次，連續(xù)治療3 d。

1.4 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后，按指標(biāo)檢測要求取材，具體操作如下：0.3 mL／kg的10%水合氯醛劑量腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉完全后腹正中線切開腹腔，分離出腹主動脈后以采血針+真空管采集腹主動脈血液，隨即冰鹽水灌注取腦。

1.5 神經(jīng)行為學(xué)評價 參照Zealonga神經(jīng)損害評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分。向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。1～3分說明造模成功。

1.6 腦梗死體積計算 使用TTC染色法檢測大鼠腦梗死的面積。各組大鼠斷頭取腦后將腦組織置于-20℃冰箱冷凍15 min至腦組織變硬，用鋒利刀片將大腦自大腦半球額極至枕極做連續(xù)冠狀位切片，每片厚約2 mm，切成6片。將腦片放入1%TTC磷酸緩沖液（PH＝7.4）后用錫箔紙蓋住后，置于37℃溫箱10～15 min，用毛筆不時翻動腦片，使腦片均勻接觸到染色液。TTC與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故腦梗死組織呈蒼白色。利用ImageProPlus 6.0分析軟件對腦梗死面積進行計算，然后得出腦梗死體積（梗死體積＝梗死面積和×2 mm）。

1.7 Western-blotting法測定蛋白水平變化 將所取大腦皮質(zhì)200 mg，加入1 mL裂解液，4℃進行勻漿，15 000 r／min離心后取上清液，取25 mL上清液進行BCA法測定濃度并計算上樣量。將上清液和上樣緩沖液按照4∶1比例混勻后置于100℃的金屬浴中變性7 min。電泳（6%濃縮膠，12%分離膠，60V 145 min）結(jié)束后將凝膠取出，進行轉(zhuǎn)印（100V 2 h）之后將PVDF膜取出，用麗春紅對PVDF膜上的蛋白質(zhì)進行預(yù)染，以證實蛋白質(zhì)確實轉(zhuǎn)移到膜上。使用TBST配置而成的5%脫脂奶粉進行封閉2 h，TBST洗3次，每次10 min，分別加入相應(yīng)抗體，4℃環(huán)境孵育過夜后TBST洗3次，每次5 min，再用堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶1 000）室溫1 h，TBST洗3次，每次5 min。將PVDF膜放入顯影儀器平板中，滴入ECL化學(xué)顯影劑反應(yīng)1 min后顯影，計算機掃描，數(shù)據(jù)處理。

1.8 rtPCR法測定基因水平變化 根據(jù)NCBI中Genebank基因庫的設(shè)計引物序列，擴增片段長度約100～300 bp。用0.1%DEPC水過夜室溫或37℃處理1.5 mL Eppendorf管和取液用10μL，200μL和1 mL Tip，高溫蒸氣滅菌，80℃烘干備用。將300 mg大鼠大腦皮質(zhì)組織加入4.5 m LTrizol提取液于冰上快速研磨后置于離心機中以12 000 r／min速度離心后取上清液，將上清液吸于另一新離心管后加入1 mL氯仿，用力震蕩15 s，冰上放置5 min，再12 000 r／min，4℃離心15 min，將上清液吸于另一新離心管后加入3 mL異丙醇后均勻混合，冰上放置15 min，12 000 r／min，4℃離心15 min后棄上清液，加入1 mL 75%乙醇輕輕搖晃，再7 500 r／min，4℃離心5 min后將乙醇液棄去，冰上靜置10 min后加入DEPC-H2O溶解總RNA后進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄過程：95℃（6 min）→55℃（90 s）→72℃（90 s）→72℃（10 min）→5℃（1 h）。Real-Time PCR操作方法按照試劑盒說明書，使用GAPDH作為內(nèi)部參照，將GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過ABI7500軟件獲得檢測指標(biāo)Ct（cycle threshold）值，與同樣本中GAPDH的Ct值相減，即獲得該樣本中相應(yīng)指標(biāo)的ΔCt值。以假手術(shù)組ΔCt值作為校正，軟件根據(jù)2-ΔΔCT數(shù)值計算得出檢測指標(biāo)基因濃度水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間顯著性比較采用t檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，組間顯著性比較采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 電針對大鼠腦梗死面積的影響 電針組的SD大鼠腦梗死面積明顯小于模型組（P＜0.01），見表1。

表1 各組梗死體積變化比較（m2）

2.2 電針對大鼠CREB蛋白水平的影響 電針組的SD大鼠CREB蛋白水平明顯高于模型組（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組CREBWestern-blotting結(jié)果比較

2.3 電針對大鼠CREB基因水平的影響 電針組的SD大鼠CREB基因水平明顯高于模型組（P＜0.01），見表2。

表2 CREB基因變化比較（±s，光密度）

表2 CREB基因變化比較（±s，光密度）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01。

組別CT（CREB）CT（GAPDH）2-△△CT假手術(shù)組23.99±1.49 20.90±1.23 1模型組28.04±1.28 22.89±1.55 0.23±0.77△△電針組26.63±0.83 22.46±0.83 0.48±0.44*

3 討論

CREB是一種聚在腦細(xì)胞的分子，作用在于刺激特定基因，制造蛋白質(zhì)，強化細(xì)胞彼此的連接。通過激活CREB實現(xiàn)啟動細(xì)胞內(nèi)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來促進神經(jīng)元存的目的。CREB屬于cAMP結(jié)合元件依賴蛋白，腦缺血疾病發(fā)生后蛋白激酶與ATP結(jié)合催化成cAMP的過程受抑制，機體cAMP濃度由此下降，因而抑制了CREB的激活，不利于改善神經(jīng)元的內(nèi)生長狀態(tài)，影響神經(jīng)元軸突再生[5-7]。有研究表明腦缺血后及早增強的磷酸化CREB，可阻止腦缺血半影區(qū)梗死灶的擴大，同時體外研究發(fā)現(xiàn)磷酸化CREB在介導(dǎo)神經(jīng)元對各種神經(jīng)營養(yǎng)素，如BDNF和NGF的反應(yīng)方面起重要作用。另外，CREB還可調(diào)節(jié)多種基因的表達，參與腦缺血損傷的內(nèi)源性保護機制[8-15]。

本課題實驗結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷大鼠經(jīng)過電針干預(yù)后腦梗死面積明顯縮小，CREB的表達水平明顯升高，說明電針干預(yù)可通過上調(diào)CREB的表達水平減少腦缺血再灌注損傷影響的程度，從而病情恢復(fù)，提示電針對腦缺血大鼠的神經(jīng)細(xì)胞保護機制之一，可能是通過上調(diào)CREB的表達而實現(xiàn)的。

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（2013-02-12收稿 責(zé)任編輯：徐暉）

The Im pact of Electro-Acupuncture on the Expression of CREB in Ischemia-Reperfusion Rats

Yang Shanli1，Jiang Yijing2，Tao Jing1，Chen Lidian2
（1 Rehabilitation Hospital affiliated to Fujiang University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou，350001，China；2 Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou，350108，China）

Objective：To explore the impact of electro-acupuncture on the expression of CREB in the ischemia-reperfusion rats.Methods：Sixty healthy adult SD rats which were domesticated for 3 days were randomly divided into the shame group，the model group and the electro-acupuncture group.There were 20 rats in each group.The rats of the model group and the electro-acupuncture group were given the line bolt method（MCAO）to complete the brain ischemia model，and were reperfused 2 hours after ischemia.The electro-acupuncture group adopted the intervention of electro-acupuncture.Three days after the reperfusion，all the rats were beheaded and taken brains.The cerebral infarction volume was observed through TTC staining and image analysis，and the protein expression of CREB were detected by protein imprinting method（Western blotting）and gene expression of CREB were tested by Real-Time PCR.Results：TTC and the image analysis showed that the cerebral infarction volume of electro-acupuncture group was significantly smaller than that of the model group（P＜0.01）；the CREB protein level in the electro-acupuncture group was obviously higher than that of the model group（P＜0.01）；the CREB gene level in the electro-acupuncture group was much higher than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Electro-acupuncture can realize the improvement of the cerebral ischemia reperfusion injury by up-regulating CREB.

Cerebral ischemia；Reperfusion injury；Electro-acupuncture；CREB

R245.9；R255.2

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.027

教育部博士點基金博導(dǎo)類（編號：20103519110001）；青年科學(xué)基金項目（編號：81102628）

陳立典，男，研究生，教授，校長，腦血管疾病的康復(fù)，E-mail：lidianchen87＠yahoo.com