商陸皂苷甲致腎細(xì)胞毒性的研究

周 倩 姚廣濤 金若敏 謝家駿

（上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價研究中心，上海，201203）

商陸皂苷甲致腎細(xì)胞毒性的研究

周 倩 姚廣濤 金若敏 謝家駿

（上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價研究中心，上海，201203）

目的：考察商陸皂苷甲Esculentoside A（EsA）對人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）的毒性。方法：1）MTT法測細(xì)胞活力；2）檢測細(xì)胞上清液LDH、細(xì)胞內(nèi)SOD及MDA；3）采用倒置顯微鏡及電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)；4）采用Hoechst-PI染色及流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果：1）EsA對腎細(xì)胞的活力有顯著的抑制作用，其IC50為149.11μg·mL-1，且存在一定的時效和量效關(guān)系；2）EsA能升高腎細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH，使腎細(xì)胞內(nèi)SOD／MDA比值有所下降；3）EsA能使腎細(xì)胞及其超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)凋亡或壞死，有一定的量效關(guān)系。結(jié)論：大于100μg·mL-1濃度的商陸皂苷甲對HK-2細(xì)胞有一定的毒性，其毒性機(jī)制與細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡等相關(guān)。

商陸皂苷甲；HK-2細(xì)胞；腎細(xì)胞毒性

商陸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為商陸屬植物商陸（Phytolacca acinosaRoxb.）和垂序商陸（Phytolacca americanaL.）的干燥根，為瀉下逐水藥，其性寒，味苦辛，有毒，歸肺、腎、大腸經(jīng)[1]?，F(xiàn)代研究顯示，商陸具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤、消炎抗菌、利尿等多種藥理作用，過量服用商陸的不良反應(yīng)有神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[2-5]，課題組研究曾指出，商陸能對大鼠的腎臟產(chǎn)生一定的毒性[6]。本文選用主要成分之一商陸皂苷甲，探討其對腎細(xì)胞的直接毒性。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 HK-2細(xì)胞即人腎小管上皮細(xì)胞，由上海中科院細(xì)胞庫提供。

1.2 試劑及材料 商陸皂苷甲（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度＞98%，批號：120417）；DMEM／F12培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；青霉素-鏈霉素抗體（Gibco公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；MTT、PI、Hoechst33342（Sigma公司）；LDH（日本世諾臨床診斷制品株式會社）；SOD、MDA、超微量蛋白（南京建成生物研究所）；二甲基亞砜（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。培養(yǎng)基配置：DMEM／F12+10%胎牛血清+1%雙抗。

1.3 儀器 BioTek全自動酶標(biāo)儀；歐林巴斯BX51正置顯微鏡、IX70倒置系統(tǒng)顯微鏡；日立7080全自動血液生化儀。

2 方法

2.1 EsA對腎細(xì)胞活力的影響 將處于對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為8×104個·mL-1），每孔加入180μL，培養(yǎng)24 h后分別加入6個不同濃度的EsA，每個濃度6孔，另設(shè)陰性平行對照組，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，避光加入5 g／L MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，加入二甲基亞砜（150μL／well），振蕩混勻，另設(shè)一調(diào)零孔（DMSO），于酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處測吸光度A，計算細(xì)胞活率。重復(fù)實驗3次。細(xì)胞活率＝（藥物組平均A-調(diào)零孔A）÷（對照組平均A -調(diào)零孔A）×100%。

細(xì)胞同上方法處理，培養(yǎng)24 h后加入EsA，使其終濃度為150μg·m L-1，分別于2、4、8、12、18、24 h，避光加入5 g／LMTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清。加入二甲基亞砜（150μL／well），同上法測定吸光度A，重復(fù)實驗3次。

2.2 EsA對腎細(xì)胞上清液LDH、細(xì)胞內(nèi)SOD及MDA的影響

2.2.1 上清液LDH的檢測 同2.1法將細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為18×104個·mL-1）接種于24孔板。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別以含50、100、150、200μg·mL-1商陸皂苷甲的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞，另設(shè)陰性平行對照組，每組3孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3000 r／min離心5 min，取上清液立即用日立7080全自動血液生化儀測LDH含量。2.2.2 SOD及MDA的檢測 將處于對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為25×104個·mL-1，接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h后分別以含25、50、100μg·mL-1商陸皂苷甲的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞，另設(shè)陰性平行對照組。培養(yǎng)24 h后，胰酶消化收集各組細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2次細(xì)胞后，用適量生理鹽水超聲裂解細(xì)胞，3000 r／min離心5 min后取適量上清液，檢測SOD及MDA，并對蛋白定量。

2.3 EsA對腎細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3.1 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 同2.2.1法處理細(xì)胞后，以倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.3.2 電鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將HK-2細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別以25、50、100μg·m L-1商陸皂苷甲的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞，另設(shè)陰性平行對照組。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清，用PBS溶液洗滌2次，加入預(yù)冷電鏡液使細(xì)胞固定5 min，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞于1.5 mL離心管中，1200 r／min離心5 min后棄上清，加入適量預(yù)冷的電鏡液置4℃冰箱保存細(xì)胞，送基爾頓生物科技有限公司進(jìn)行電鏡檢測。

2.4 EsA對腎細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 Hochest33342-PI染色觀察腎細(xì)胞的凋亡／壞死 同2.2.1對細(xì)胞進(jìn)行處理，給藥24 h后，于培養(yǎng)液中加入終濃度為10μg·mL-1的Hoechst33342，37℃反應(yīng)10 min后，繼續(xù)加入終濃度為10μg·mL-1的PI，4℃反應(yīng)20 min后，立即用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

2.4.2 流式細(xì)胞儀測腎細(xì)胞凋亡 將處于對數(shù)生長期HK-2腎細(xì)胞分別經(jīng)0.25%胰酶消化后，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后分別以含25、50、100、150μg· m L-1商陸皂苷甲的完全培養(yǎng)液處理細(xì)胞，給藥24 h后，用胰酶消化收集各組細(xì)胞，1200 r／min離心5 min后，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液后收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中，交由上海中醫(yī)藥大學(xué)生化毒理室進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，采用方法：AnnexinV-PI測細(xì)胞凋亡。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS 15.0軟件分析數(shù)據(jù)，實驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)均用（ˉx±s）表示，單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett’s法。P＜0.01和P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義；IC50用Bliss法計算。

3 結(jié)果

3.1 EsA對腎細(xì)胞活力的影響 與對照組相比，50～200μg·mL-1EsA組HK-2細(xì)胞活力明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且呈一定的劑量依賴性，IC50為149.11μg·m L-1，見表1。

與對照組相比，150μg·mL-1EsA作用2 h后，各組HK-2細(xì)胞活力均明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且呈一定的時間依賴性，見表2。

表1 EsA對HK-2細(xì)胞活力的影響（±s，n＝6）

表1 EsA對HK-2細(xì)胞活力的影響（±s，n＝6）

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

A Cell Viability／% Control—Group Dose／（μg·mL-1）0.322±0.006 100.00±1.86 EsA 200 0.054±0.015**16.77±4.66**150 0.157±0.011**48.76±3.42**100 0.272±0.009**84.47±2.80**50 0.291±0.002**90.37±0.62**25 0.318±0.005 98.76±1.55 12.5 0.315±0.008 97.83±2.48

表2 150μg·mL-1EsA對HK-2細(xì)胞活力的影響（±s，n＝6）

表2 150μg·mL-1EsA對HK-2細(xì)胞活力的影響（±s，n＝6）

Note：*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group Time（h）Cell Viability／% 2 0.629±0.018 100.00±2.86 0.384±0.011**61.05±1.75 Control A Cell Viability／% 150μg·mL-1EsA A ** 4 0.589±0.037 100.00±6.28 0.280±0.027**47.54±4.58**8 0.587±0.019 100.00±3.24 0.275±0.005**46.85±0.85**12 0.587±0.039 100.00±6.64 0.236±0.007**40.20±1.19**18 0.490±0.016 100.00±3.26 0.196±0.021**40.00±4.28**24 0.524±0.023 100.00±4.39 0.189±0.007**36.07±1.34**

3.2 EsA對腎細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH、細(xì)胞內(nèi)SOD及MDA的影響 與對照組相比，150和200μg·mL-1EsA組的HK-2細(xì)胞上清液中LDH含量明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。

與對照組相比，25～100μg·mL-1EsA作用24 h后，各組的HK-2細(xì)胞中SOD、MDA分別出現(xiàn)相應(yīng)的降低和升高現(xiàn)象，SOD／MDA明顯降低，見表4。

表3 EsA對HK-2細(xì)胞上清LDH的影響（±s，n＝3）

表3 EsA對HK-2細(xì)胞上清LDH的影響（±s，n＝3）

Note：**P＜0.01 vs control

Group Dose／（μg·m L-1）LDH／（IU·L-1）Control—65.67±1.53 EsA 200 172.33±2.52**150 147.00±3.61**100 67.33±4.93 50 64.00±1.00

表4 EsA對HK-2細(xì)胞SOD、MDA的影響

3.3 EsA對腎細(xì)胞形態(tài)的影響

3.3.1 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 正常HK-2細(xì)胞間連接緊密，貼壁生長，形態(tài)呈鵝卵石樣，200μg·m L-1EsA組的腎細(xì)胞基本死亡漂浮于培養(yǎng)液中，150μg· mL-1EsA組的腎細(xì)胞數(shù)量大量減少、細(xì)胞皺縮變圓、部分死亡細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中，100μg·mL-1EsA組的腎細(xì)胞數(shù)量明顯減少、少量細(xì)胞脫壁死亡，50μg· mL-1EsA組的腎細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變，附圖1。

圖1 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響（×200）

3.3.2 超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞形態(tài) 正常對照組HK-2細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整、核形態(tài)不規(guī)則，100μg·mL-1EsA組大部分線粒體被破壞、細(xì)胞核中有明顯較大的圓形致密物，50μg·mL-1EsA組細(xì)胞核大、細(xì)胞膜和核膜扭曲內(nèi)陷、大部分線粒體破壞及腫大，25μg·mL-1EsA組細(xì)胞核大小不等且不規(guī)則、線粒體腫大破壞，見圖2。

3.4 EsA對腎細(xì)胞凋亡／壞死的影響 Hoechst-PI染色顯示：正常細(xì)胞呈淡藍(lán)色，早期凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色，晚期凋亡／壞死細(xì)胞呈橘紅色。正常對照組與50 μg·mL-1EsA組HK-2細(xì)胞基本正常，隨著藥物濃度增加，凋亡／壞死細(xì)胞不斷增加，200μg·mL-1EsA組的腎細(xì)胞基本均處于晚期凋亡或壞死狀態(tài)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，見圖3。

流式細(xì)胞儀檢測顯示：HK-2腎細(xì)胞在25～150 μg·mL-1EsA作用24 h后，細(xì)胞凋亡發(fā)生的比率由5.32%上升到18.46%，存在一定的量效關(guān)系，見表5。

圖2 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細(xì)胞凋亡的影響（×200）

表5 商陸皂苷甲（EsA）對HK-2細(xì)胞凋亡的影響

4 討論

商陸皂苷甲（EsA）在商陸中的含量約為0.4%[7]，其既是商陸的主要及活性成分，又是其毒性成分之一。體內(nèi)研究，給予大鼠商陸水煎液35 d可致腎臟損傷，其病理損傷主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞變性、蛋白管型，且恢復(fù)期部分損傷可逆[6]。文獻(xiàn)報道，商陸皂苷甲能夠引起B(yǎng)XSB小鼠腎小球和腎小管細(xì)胞的凋亡，其作用機(jī)理可能與下調(diào)BXSB小鼠腎組織中Bcl-2（凋亡調(diào)節(jié)蛋白）的表達(dá)和Bcl-2／Bax的比值從而加速細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]。人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞系）是成人腎細(xì)胞，其功能接近原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，已經(jīng)成為研究各種藥物腎毒性及腎小管損傷機(jī)制的重要細(xì)胞模型[9-11]。

本研究表明，大于100μg·mL-1商陸皂苷甲對HK-2細(xì)胞（人腎小管上皮細(xì)胞）有明顯的毒性作用，提示商陸皂苷甲可能是中藥商陸致腎毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其對腎細(xì)胞毒性機(jī)制與致細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)。

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（2014-01-06收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng)）

Study on Renal Cell Toxicity Induced by Esculentoside A

Zhou Qian，Yao Guangtao，Jin Ruomin，Xie Jiajun
（Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

Objective：To investigate the toxicity of Esculentoside A on HK-2 cells（Human renal tubular epithelial cells）.Methods：1）MTT assay was used to test the cell viability.2）The LDH in cells supernatant，SOD and MDA in the cells were detected.3）Morphological changes of the cells were observed through inverted phase contrast microscope and electron microscopy.4）Cell apoptosis was detected by Hochest33342-PI dyeing and flow cytometry.Results：1）Esculentoside A could inhibit nephrocyte viability dependently on time and dose（IC50 was149.11μg·mL-1）.2）Esculentoside A could increase the activity of LDH in nephrocyte supernatant，reduce SOD activity and increase MDA content in nephrocytes.3）Esculentoside A could cause damage of nephrocyte structure，cell apoptosis and necrosis.Conclusion：It showed that large dose of Esculentoside A（more than 100μg·m L-1）has toxicity on HK-2 cells and the mechanisms of toxicity may include cellular oxidative damage and cell apoptosis.

Esculentoside A；HK-2 cells；Renal cell toxicity

R285.5

A

10.3969／j.issn.1673-7202.2014.02.006

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（編號：2009CB522807）；國家“十二五”科技重大專項課題“中藥安全評價技術(shù)平臺”（編號：2011ZX09301-009）

周倩（1988—），女，碩士研究生，中藥安全性評價，E-mail：423384692＠qq.com

姚廣濤，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新藥及其安全性評價研究，Tel：（021）51322472，E-mail：ygt1969＠yahoo.com.cn