飼料中添加益生菌或植物提取物對凡納濱對蝦生長、免疫力及抗病力的影響

■劉泓宇 李 正 孫武衛(wèi) 譚北平 董曉慧 遲淑艷 楊奇慧

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088；2.建明工業(yè)（珠海）有限公司，廣東珠海519040）

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)又名南美白對蝦，是中國重要的養(yǎng)殖品種，也是中國出口創(chuàng)匯的主要種類之一。近年來由于高密度養(yǎng)殖、水體污染和種苗體質(zhì)脆弱等因素導(dǎo)致蝦病爆發(fā)造成產(chǎn)量下降。為了提高蝦的成活率和產(chǎn)量，養(yǎng)殖戶不得不大量使用藥物，特別是抗生素和其他違禁藥物的使用，最終導(dǎo)致藥物殘留，不但影響了對蝦產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康穩(wěn)定發(fā)展，也不利于中國生態(tài)農(nóng)業(yè)的建設(shè)與發(fā)展。尋找一種有利于水產(chǎn)動物健康生長，而又不危害食品安全是解決當(dāng)前水產(chǎn)動物生長與食品安全之間矛盾的重要途徑。目前，已有學(xué)者做了相關(guān)方面的研究[1-9]，發(fā)現(xiàn)益生菌和植物提取物不但能促進水產(chǎn)動物存活和生長[10-11]，也能提高水產(chǎn)動物免疫力[9,12-13]，在動物體內(nèi)無殘留，也不產(chǎn)生抗藥性。益生菌替代抗生素已經(jīng)成為當(dāng)前研究熱點[14-15]。

益生菌(Probiotics)是一種有取代或平衡生態(tài)系統(tǒng)中一種或多種菌系作用的微生物添加物,即通過補充動物消化道內(nèi)的有益微生物,改善消化道菌群平衡而對動物產(chǎn)生有益作用,迅速提高機體的抗病能力、代謝能力和對飼料的消化吸收能力,達到防治消化道疾病和促進生長雙重作用的微生物飼料添加劑[16]。近幾年，益生菌的生產(chǎn)和使用量飛速增長[14]，益生菌的使用可減少抗生素的用量，有利于生態(tài)平衡。其作用機理是為動物生長提供營養(yǎng)、增強免疫功能，預(yù)防水產(chǎn)動物疾病發(fā)生、分解有機物，凈化水質(zhì)，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境和生物奪氧[17-18]。植物提取物系從植物中提取，活性成分明確，可測定，含量穩(wěn)定,對動物和人類沒有任何毒副作用，并已通過動物試驗證明，可改善動物生產(chǎn)性能的飼料添加劑的統(tǒng)稱，可長期使用。植物提取物中的化學(xué)活性物質(zhì)還可抗菌、殺菌、抗氧化,保證動物腸道健康、提高自身免疫機能[19]，其在水產(chǎn)動物上的應(yīng)用和研究較少。為提高中國凡納濱對蝦產(chǎn)量，防治病害的發(fā)生，減少抗生素的使用，我們從凡納濱對蝦腸道分離出了益生菌菌株S12，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），對副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）、溶藻弧菌（Vibiro alginolyticus）等多種致病性弧菌均具有較強的抑制效果，同時運用了植物提取物(RapXOL，經(jīng)過特殊工藝包被的植物精油，主要成分包括牛至油、肉桂醛等)對沙門氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）等致病菌具有顯著的抑制效果。本試驗研究了凡納濱對蝦飼料中添加益生菌S12和植物提取物對凡納濱對蝦的生長、免疫力和抗病力的影響，以期為益生菌和植物提取物產(chǎn)品在凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖中的推廣應(yīng)用和對蝦配合飼料開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

在基礎(chǔ)飼料(表1)中分別添加0.3%抗生素(氟苯尼考Florfenicol，抗生素對照組)、200 mg/kg植物提取物 (RapXOL)、益生菌S12(PS1：5×109cfu/kg；PS2：5×1010cfu/kg；PS3：5×1011cfu/kg)共配制6種等氮等能飼料，各種大宗原料過篩(80目)，按照配方準(zhǔn)確稱取原料，混勻，用雙螺桿壓條機擠壓出直徑分別為1.0 mm和1.5 mm兩種粒徑的飼料，90℃熟化30 min后，自然風(fēng)干。風(fēng)干后的飼料貯存于-20℃的冰柜中。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)成分(%)

1.2 試驗分組與飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地進行。試驗用蝦為湛江東海島國聯(lián)育苗場第一代SPF蝦苗。共設(shè)6個處理組，每個處理組4個重復(fù)，每個重復(fù)放40尾[（0.4±0.01）g/尾]，前3周投喂1.0 mm粒徑的飼料，后5周投喂1.5 mm粒徑的飼料。每天投喂4次。試驗期間鹽度維持在30，水溫維持在（22±3）℃，連續(xù)充氣，換水次數(shù)隨蝦的大小而變化，養(yǎng)殖前期換水次數(shù)少，后期每天換水一次。每天觀察對蝦蛻殼、生長情況，每周隨機抽取1個養(yǎng)殖桶蝦稱重，作為調(diào)整投飼量的依據(jù)。試驗為期8周。

1.3 攻毒試驗

此試驗共攻毒2次，中期在試驗進行到第4周，每桶隨機抽取8尾蝦，末期試驗結(jié)束后，每桶隨機抽取10尾蝦。病原菌為哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)(廣東海洋大學(xué)廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)和流行病學(xué)重點實驗室提供)，在對蝦第2、第3腹節(jié)間肌肉注射。根據(jù)攻毒前預(yù)試驗結(jié)果，中期攻毒哈維氏弧菌濃度為5.0×107cells/ml，每尾蝦注射20 μl，后期哈維氏弧菌濃度為3.4×107cells/ml，每尾蝦注射30 μl。攻毒后繼續(xù)投喂飼料，統(tǒng)計每日的死亡率，持續(xù)2周，并計算累計死亡率和免疫保護率。

免疫保護率（%）=100×(1-免疫組累計死亡率/對照組累計死亡率)。

1.4 采樣與分析

試驗結(jié)束前1 d停止投喂飼料，稱取質(zhì)量并計數(shù)，隨機抽取10尾用于攻毒外其余用于取血，取完血的蝦分裝好用于蝦體成分分析。飼料常規(guī)分析和蝦體成分分析參照《飼料分析與檢測》[20]。同時計算成活率、增重率(WG)、特定生長率(SGR)和飼料系數(shù)(FCR)。

WG（%）=(Wf-Wi)/Wi×100；

SGR（%/d）=[(lnWf-lnWi)/T]×100；

FCR=Wt/(Wf-Wi)。

式中：Wf—— 表示平均終體質(zhì)量(g)；

Wi——平均初體質(zhì)量(g)；

T——飼養(yǎng)時間(d)；

Wt——試驗期間投入飼料量(g)。

1.5 免疫指標(biāo)的測定

抽取對蝦血淋巴后加ACD抗凝劑，用于血細胞計數(shù)和吞噬活性測定，同時另外抽取血淋巴不加入抗凝劑，用于血清免疫指標(biāo)測定，不加抗凝劑血淋巴4℃靜置過夜，以8 000 r/min離心10 min，取上清，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

血細胞計數(shù)(THC)測定采用譚北平等[21]等的方法。在試驗條件下,以每毫升血淋巴中的血細胞數(shù)定義。

吞噬率采用劉慧杰等[22]的方法。在試驗條件下，以100個總血細胞中吞噬菌的細胞與100個總血細胞比值定義。

酚氧化酶(PO)活力測定采用王雷等[23]的方法。在試驗條件下，以每分鐘增加0.001定義為一個酶活單位。

抗菌活力的測定以哈維氏弧菌為底物，采用王雷等[23]的方法。

溶菌酶(LSZ)活力的測定以溶壁微球菌(Micrococus lysoleikticus)凍干粉為底物，采用Jorgensen等[24]的方法。

超氧化物歧化酶(SOD)活力使用南京建成試劑盒測定。血清中SOD酶活力單位定義為每毫升血清中SOD抑制率達到50%所對應(yīng)的SOD量為1個酶活性單位。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）”表示，試驗結(jié)果用SPSS軟件包（版本16.0）進行單因素方差分析（ANOVA分析），當(dāng)單因素方差分析處理之間差異顯著（P＜0.05）時，用Tukey's檢驗進行多重比較分析。

2 結(jié)果

2.1 對凡納濱對蝦生長性能的影響（見表2）

表2 凡納濱對蝦成活率、增重率、特定生長率和飼料系數(shù)

由表2可知，對蝦成活率介于94.4%～98.9%。與空白對照組相比，添加植物提取物和益生菌可不同程度地提高對蝦成活率，其中PS1和PS3組的成活率顯著提高(P＜0.05)；對蝦增重率為1 342.47%～1 434.07%，其中抗生素組顯著高于空白對照組(P＜0.05)；特定生長率為4.77%/d～4.87%/d，同樣為抗生素組顯著高于空白對照組(P＜0.05)；飼料系數(shù)為1.10～1.12，抗生素組顯著低于空白對照組(P＜0.05)，但各試驗組之間無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 蝦體成分（見表3）

表3 添加植物提取物和益生菌對凡納濱對蝦營養(yǎng)成分的影響(%)

PS1組蝦的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于空白對照組(P＜0.05)；添加植物提取物顯著提高對蝦體蛋白(P＜0.05)，而添加益生菌對蝦體蛋白質(zhì)含量的影響不顯著；添加益生菌顯著降低蝦體脂肪(P＜0.05)；各試驗組之間蝦體灰分無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 免疫指標(biāo)（見表4）

表4 添加植物提取物和益生菌對凡納濱對蝦免疫功能的影響

添加抗生素、植物提取物和益生菌對凡納濱對蝦血細胞數(shù)，溶菌酶、酚氧化酶、SOD活力和抗菌活力均有一定提升作用(表4)?？股貙φ战M中血細胞數(shù)顯著高于其他試驗組(P＜0.05)，其他試驗組之間無顯著差異。空白對照組吞噬率顯著低于其他試驗組(P＜0.05)，PS2和PS3組與抗生素對照組相比差異不顯著。空白對照組溶菌酶活力顯著低于其他試驗組(P＜0.05)。添加植物提取物和益生菌顯著提高蝦SOD活性(P＜0.05)。除PS1組外，空白對照組抗菌活力顯著低于其他試驗組(P＜0.05)，PS3組顯著高于抗生素對照組(P＜0.05)。除PS1組外，空白對照組酚氧化酶活力顯著低于其他試驗組(P＜0.05)，其他各試驗組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 免疫力（見表5及圖1）

表5 飼料中添加植物提取物和益生菌對凡納濱對蝦感染哈維氏弧菌相對免疫保護率的影響

在第4周和第8周分別進行了1次攻毒試驗以分析生長期內(nèi)益生菌的效價。統(tǒng)計了對蝦感染哈維氏弧菌14 d后的累積死亡率。中期攻毒結(jié)果顯示，至攻毒后第14 d，空白對照組對蝦累積死亡率為45.8%，顯著高于其他試驗組(除植物提取物組和PS1組)(P＜0.05)，而其他組間差異不顯著。計算了相對于空白對照的各組相對免疫保護率，以抗生素對照組免疫保護率最高，顯著高于其他試驗組(P＜0.05)，植物提取物組最低，顯著低于其他實驗組(P＜0.05)。PS組間免疫保護率差異不顯著。

末期攻毒試驗結(jié)果顯示，至攻毒后第14 d，空白對照組累積死亡率為83.3%，顯著高于其他組（P＜0.05）。植物提取物組累積死亡率顯著高于抗生素對照組和益生菌組（P＜0.05），抗生素對照組與益生菌組相比差異不顯著。計算了相對于空白對照組的各組相對免疫保護率，以植物提取物組免疫保護率最低，顯著低于其他試驗組（P＜0.05），其他各組間差異不顯著。

圖1 凡納濱對蝦4周(A)和8周(B)時感染哈維氏弧菌累積死亡率

3 討論與結(jié)論

在此研究中，飼料添加植物提取物和益生菌可不同程度提高對蝦的成活率、增重率和特定生長率，飼料中添加益生菌S12可顯著提高凡納濱對蝦的成活率，與斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[25]、凡納濱對蝦(L.vannamei)[26，6]、暗紋東方鲀(Fugu obscurus)[27]和鯉魚(Cyprinus carpio)[9]中的研究結(jié)果相似。植物提取物和益生菌對凡納濱對蝦的促生長機理，可能是由于植物提取物和益生菌能提高對蝦腸道消化酶活性和改善腸道菌群[6,26-27]，從而提高凡納濱對蝦對飼料的攝食和消化能力；同時益生菌在其生長和繁殖過程中，能自身合成VC、VB1、VB2和VB6以及氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，為動物提供營養(yǎng)物質(zhì)[25]，最終促進凡納濱對蝦成活率的提高和生長率加快。芽孢桿菌菌株因為能夠形成孢子，對環(huán)境物理和化學(xué)因子作用具有較強抗性，因而被廣泛用作益生菌。通常芽孢桿菌菌株能夠產(chǎn)生胞外酶，在很大程度上與海洋環(huán)境相關(guān)聯(lián)。例如，芽孢桿菌可從甲殼動物和雙殼類動物的腸道分離得到。本試驗結(jié)果與胡毅等的研究結(jié)果一致[6]。芽孢桿菌屬益生菌，對多種魚類病原體可表現(xiàn)出較強的抑制活性；同時益生菌能夠產(chǎn)生消化酶和生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)如維生素和氨基酸，從而可改善飼料的吸收，進而促進動物的生長。

水分、蛋白質(zhì)、脂肪、礦物元素是機體組分，其含量體現(xiàn)了機體的營養(yǎng)價值。王彥波[28]添加益生菌B.coagμlans顯著降低羅非魚肌肉脂肪含量，但對粗蛋白、灰分和水分無顯著影響。仇明等[25]添加枯草芽孢桿菌顯著降低斑點叉尾鮰肌肉灰分含量，但對粗蛋白、水分無顯著影響。此研究中，添加益生菌S12顯著降低對蝦的全蝦脂肪和PS1組全蝦水分，對蛋白質(zhì)、灰分無顯著影響。與空白對照組相比，添加200 mg/kg植物提取物顯著提高全蝦蛋白質(zhì)的含量，對水分、脂肪和灰分的含量無顯著影響；益生菌S12顯著降低對蝦全蝦脂肪可能是在益生菌的作用下，通過一系列的酶反應(yīng)，導(dǎo)致機體的脂肪代謝加強，脂肪酸合成速度被抑制，最終降低了體脂沉積[28]。植物提取物顯著提高全蝦蛋白質(zhì)可能是其抑制有害菌活性，改善了機體對營養(yǎng)素的消化吸收，減少了營養(yǎng)物質(zhì)損耗，最終提高了體蛋白質(zhì)沉積。

甲殼動物的免疫機制屬于非特異性免疫，主要由血細胞以及存在于血細胞或從血細胞釋放到血淋巴中的活性因子形成的，以抵御病原體侵入。血細胞數(shù)(THC)、溶菌酶(LSZ)、酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和抗菌活力是衡量對蝦免疫能力的重要指標(biāo)，在對蝦免疫過程中發(fā)揮重要作用。在此研究中，添加植物提取物和益生菌能不同程度地提高對蝦血細胞數(shù)、吞噬率、溶菌酶、酚氧化酶、SOD和抗菌活力活性。PS2和PS3組的SOD、PS3組抗菌活力顯著高于抗生素對照組，植物提取物組除溶菌酶和抗菌活力外都低于抗生素組，推測其含量可能未達到應(yīng)有的水平，致使未能達到與抗生素相似的效果。攻毒結(jié)果顯示，與空白對照組相比，添加益生菌第4周（除PS1組外）和第8周時顯著降低感染哈維氏弧菌的對蝦累積死亡率，添加植物提取物第8周時顯著降低感染哈維氏弧菌的對蝦累積死亡率；在末期（第8期）攻毒試驗中抗生素組和益生菌對感染哈維氏弧菌的對蝦的累積死亡率和免疫保護率都無顯著性差異。Rengpipat等添加芽孢桿菌提高了斑節(jié)對蝦酚氧化酶和抗菌活力[8]；Kim等[12]添加益生菌能促進了虹鱒（Oncorhynchus mykiss）特異性免疫能力；Salinas等[29]添加益生菌提高了烏頰魚（Gilthead Seabream）的特異性免疫能力；繆凌鴻等[9]添加植物提取物提高了鯉(Cyprinus carpio)的抗病能力。本試驗中，與抗生素對照組相比，第4周試驗組各組的累積死亡率無顯著性差異，但試驗組均高于抗生素對照組；第8周益生菌各處理組累積死亡率與抗生素對照組無顯著性差異，且小于或等于抗生素對照組。說明益生菌在凡納濱對蝦體內(nèi)定植并發(fā)揮免疫激活功能具有時間積累效應(yīng)，充分的投喂周期可保證益生菌在凡納濱對蝦體內(nèi)發(fā)揮免疫激活作用。綜上研究表明，植物提取物和益生菌可作為良好的免疫激活劑，通過激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫以增強機體免疫機能[6]。

在本試驗條件下，添加植物提取物顯著提高全蝦蛋白質(zhì)含量，添加益生菌顯著降低飼料中脂肪含量。添加植物提取物和益生菌顯著提高了凡納濱對蝦免疫能力，可作為良好的免疫增強劑。以存活率、免疫指標(biāo)和免疫保護率為指標(biāo)，飼料中益生菌S12最適添加量為5×1010cfu/kg，至于飼料中植物提取物的最適添加量，尚待進一步研究。