屋塵螨致敏蛋白組分Der p1、Der p2和Der p10檢測的臨床意義

鄭佩燕，孫寶清

(呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼吸疾病國家臨床研究中心 廣州呼吸疾病研究所 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，廣州 510120)

1964年，Voorhort等提出螨是屋塵中主要的變應(yīng)原[1]，此后螨作為吸入性抗原在變態(tài)反應(yīng)性疾病中所占的地位逐漸被重視。螨的分泌物、排泄物及其尸體降解產(chǎn)物等都是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的氣傳變應(yīng)原，可引發(fā)I型變態(tài)反應(yīng)，如螨性變應(yīng)性哮喘、變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性皮炎、蕁麻疹等，且發(fā)病率有逐年增高的趨勢，已被世界衛(wèi)生組織列為當(dāng)前世界性的重大公共衛(wèi)生問題之一[2]。近年來，變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率呈逐年增高趨勢，而組分變應(yīng)原在變態(tài)反應(yīng)性疾病診斷和治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和前景，正成為此領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。在臨床上，特異性變應(yīng)原IgE檢測對診斷變態(tài)反應(yīng)性疾病的特異性和敏感性已得到很多研究的認(rèn)同。然而，變應(yīng)原IgE組分檢測對臨床診斷的意義和作用，國內(nèi)外均研究較少。本文欲從屋塵螨組分IgE在變態(tài)反應(yīng)性疾病體外診斷中的作用探討組分分析在的診斷中的可能意義和作用，就屋塵螨主要組分Der p1、Der p2和Der p10的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

塵螨組分研究現(xiàn)狀

塵螨(Dermatophagoides， house dust mite)是最重要的常見吸入性變應(yīng)原之一，特別是屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)，全球人口約20%和超過50%變態(tài)反應(yīng)性疾病患者對這2種變應(yīng)原存在變態(tài)反應(yīng)[3-4]。塵螨是最常見觸發(fā)哮喘和變應(yīng)性鼻炎的變應(yīng)原[5-6]，Der p1和Der p2是塵螨的主要變應(yīng)原，其敏感性IgE檢測和臨床意義已有很多研究。90%以上對屋塵螨存在變態(tài)反應(yīng)者對這2種組分均有變應(yīng)性[7]。研究已經(jīng)分離出20多種屋塵螨組分，但只有少數(shù)幾種組分有所研究[8]。這些變應(yīng)原組分中，Der p10為原肌球蛋白，已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，因?yàn)樗菬o脊椎動(dòng)物產(chǎn)生交叉反應(yīng)的變應(yīng)原[9]，特別是對海鮮。研究顯示，Der p10是一種導(dǎo)致全身性嚴(yán)重變態(tài)反應(yīng)的重要變應(yīng)原[10]。有研究表明，不同人群對屋塵螨變應(yīng)原組分變應(yīng)原存在差異性，使用不同變應(yīng)原組分進(jìn)行特異性免疫治療(specific immunotherapy，SIT)時(shí)，其臨床效果也不同[11]。

1988年，Chua等[12]成功合成了Der p1變應(yīng)原DNA克隆序列，并證明了它可編碼包括222個(gè)氨基酸殘基的蛋白序列，其相對分子質(zhì)量為25000，包含1個(gè)潛在的N末端糖基化位點(diǎn)。該cDNA還可編碼1個(gè)13個(gè)殘基的前區(qū)及1個(gè)不完整的單膚鏈。此序列與動(dòng)植物半朧氨酸蛋白酶有高度的同源性，尤其是在構(gòu)成活性位點(diǎn)處的殘基。用Southern法分析其基因序列顯示，該變應(yīng)原為非鄰接的基因所編碼。

Der p1屬于半胱氨酸蛋白酶家族，人們利用其他半胱氨酸蛋白酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)建了Der p1的模型。Der p1是與臨床相關(guān)最密切的蛋白質(zhì)，它與螨過敏癥患者IgE的結(jié)合率達(dá)到70%～80%，Der p1大量存在于屋塵螨排泄的糞團(tuán)中(每個(gè)顆粒約含0.1 ng)，且占屋塵螨提取液IgE的50%以上[13-14]。屋塵螨過敏患者的住所可以檢測到高水平的Der p1，塵螨過敏患者的肺泡灌洗液中可以檢測到納克級的Der p1，提示黏膜中Der p1濃度可能達(dá)到毫克級水平。進(jìn)入呼吸道后，Der p1可在1 min內(nèi)迅速從排泄物小球中洗脫，而氣道液體中高水平谷胱甘肽可能對Der p1活性起保護(hù)作用。屋塵螨變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生率與屋塵中Der p1濃度和個(gè)體中IgE水平之間顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，正常人體內(nèi)僅有低濃度的抗Der p1 IgG抗體存在，而大部分屋塵螨皮試陽性的成人哮喘患者和超過90%的塵螨過敏者有Der p1特異性IgE、IgA和IgG抗體存在[15]。Der p1特異性IgE抗體可以保護(hù)Der p1免受內(nèi)源性蛋白酶的影響，并引導(dǎo)Der p1至細(xì)胞表面與受體結(jié)合。隨著屋塵中Der p1水平的增加，屋塵螨致敏的危險(xiǎn)性也顯著增加。哮喘患者Der p1水平的季節(jié)性變化也和氣道高反應(yīng)性有關(guān)，而Der p1水平可能在夏末和秋季到達(dá)峰值[16]。Der p1半胱氨酸蛋白酶活性的重要性還在于其可增強(qiáng)體內(nèi)總IgE和Der p1特異性IgE的合成能力[17]。CD8+T細(xì)胞抑制IgE產(chǎn)生，通過誘導(dǎo)向輔助T細(xì)胞1的免疫偏移抑制吸入變應(yīng)原的變態(tài)反應(yīng)。值得注意的是，Der p1誘導(dǎo)的CD 25水解對于CD8+T細(xì)胞存在強(qiáng)烈的抗增殖作用[18]。這說明Der p1的蛋白酶活性有利于IgE合成，通過消除CD8+T細(xì)胞減少對IgE的抑制作用。

1990年，Chua等[19]又通過變態(tài)反應(yīng)患者血清IgE修飾放免分析的方法，從Der p cDNA組成的lambda gtll基因庫中篩選分離出Der p2克隆。重組Der p2的cDNA序列編碼129個(gè)氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為14 000，無N端糖基化作用位點(diǎn)，它可在大腸桿菌中表達(dá)為1種有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的融合蛋白[20]，并可在酵母菌中表達(dá)為1種與轉(zhuǎn)化酶信號肽相融合的重組蛋白[21]。將該克隆序列在大腸埃希氏桿菌中表達(dá)，生成的Der p2與17份螨過敏患者血清中的14份反應(yīng)，說明該變應(yīng)原亦為屋塵螨的主要變應(yīng)原之一。第2組塵螨變應(yīng)原在誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)疾病方面與第1組變應(yīng)原同樣重要。Der p2與螨過敏患者的IgE結(jié)合率約為80%。對第2組變應(yīng)原組分抗體的研究表明，此組抗原與消化道和其他未被鑒定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。以往人們曾提出，第2組變應(yīng)原組分是溶酶體酶，其與附睪蛋白質(zhì)的1個(gè)家族相似，可能是附睪分泌物，而雄螨生殖道內(nèi)可形成大部分此種物質(zhì)。Der p2完全由若干以單結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白折疊的片段組成，與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶第8凝血因子的第3、4結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上高度同源。

在cDNA表達(dá)文庫中進(jìn)行IgE篩選，分離出了Der p10，相對分子質(zhì)量為33 000。cDNA克隆分析表明，Der p10與動(dòng)物原肌球蛋白有很高的同源性，與無脊椎動(dòng)物原肌球蛋白的序列同源性為65%，有75%的序列與其他節(jié)肢動(dòng)物的原肌球蛋白同源，有60%與哺乳動(dòng)物的原肌球蛋白同源。Der p10與胰蛋白酶有45%的一致性，與糜蛋白只有32%的一致性。Der p10和Der f10相比，在全序列中只有3個(gè)氨基酸不同，序列一致性達(dá)98.5%，而他們與其他變應(yīng)原相比只有80%的序列一致性。研究已經(jīng)證實(shí)，原肌球蛋白與海產(chǎn)品變應(yīng)原有臨床相關(guān)性，但作為屋塵螨的原肌球蛋白Der p10還沒有詳細(xì)的報(bào)道?，F(xiàn)已明確，提純重組的Der p10等價(jià)于與IgE反應(yīng)的天然Der p10，并對其與屋塵螨過敏患者的IgE反應(yīng)性和變應(yīng)性活動(dòng)進(jìn)行了評估[22]。

塵螨組分在變態(tài)反應(yīng)性疾病體外診斷的作用

組分變應(yīng)原診斷是目前變態(tài)反應(yīng)性疾病診斷領(lǐng)域最先進(jìn)的技術(shù)。該技術(shù)通過定量檢測單個(gè)、純化變應(yīng)原分子的特異性IgE使變態(tài)反應(yīng)性疾病的診斷更加精確。每種變應(yīng)原都含有多種蛋白質(zhì)組分，且每種組分的含量和變應(yīng)原性也是不同的。這些變應(yīng)原蛋白組分可以根據(jù)其結(jié)構(gòu)的相似性分成不同蛋白質(zhì)家族。同一蛋白質(zhì)家族的蛋白組分也具有相似的穩(wěn)定性和變應(yīng)原性。目前，已發(fā)現(xiàn)與變態(tài)反應(yīng)有密切關(guān)系的蛋白質(zhì)家族包括PR-10蛋白、貯藏蛋白、LTP非特異性轉(zhuǎn)脂蛋白、碳水化合物標(biāo)記物CCD、前纖維蛋白、原肌球蛋白、血清蛋白等[23]。如Bet v1是樺樹花粉的主要變應(yīng)原組分，屬于PR-10蛋白質(zhì)家族[23-24]，其相同家族的蛋白組分在蔬菜和水果中廣泛存在，可以導(dǎo)致樺樹花粉-食物變態(tài)反應(yīng)。

變應(yīng)原蛋白組分抗原性的強(qiáng)弱與其特異性IgE的結(jié)合能力及其濃度有關(guān)。Der p1、Der p2和Der p10作為屋塵螨的主要變應(yīng)原組分與變態(tài)反應(yīng)性疾病有重要的聯(lián)系。研究表明，Der p1具有半胱氨酸蛋白酶活性，可能引起氣道表皮細(xì)胞脫落、細(xì)胞因子釋放和促進(jìn)變應(yīng)原分子穿越表皮細(xì)胞[25]。同時(shí)，屋塵螨過敏的鼻炎和哮喘兒童屋塵螨特異性IgE水平與Der p1、Der p2特異性IgE水平正相關(guān)[15]。Der p2特異性IgE水平明顯高于Der p1，提示Der p2擁有更高的免疫活性。免疫治療后，首先出現(xiàn)Der p2特異性IgE水平降低，而Der p1特異性IgE水平需要更長時(shí)間的免疫治療后才會出現(xiàn)降低[11]。

有研究顯示，在47例有癥狀的塵螨過敏患者中，57.4%顯示Der p1和Der p2特異性IgE陽性，6.4%僅對Der p1特異性IgE陽性，8.5%僅對Der p2陽性，而27.6%顯示對Der p1和Der p2特異性IgE均為陰性[26]。研究表明，95%歐洲中部塵螨過敏患者主要是對Der p1和Der p2過敏，其他則表現(xiàn)出對其他組分如Der p10過敏[27]。有研究者從廣州、南京、成都和沈陽4個(gè)城市收集100份血清標(biāo)本，選用標(biāo)本幾乎均為屋塵螨單一特異性IgE陽性，且檢測結(jié)果大于50 kUL，用變應(yīng)原芯片法檢測103種變應(yīng)原組分，結(jié)果顯示Der p1和Der p2為主要變應(yīng)原，其特異性IgE陽性率分別為95%和94%，而Der p10特異性IgE陽性率僅為2%[28]。Resch等[22]通過對1322例屋塵螨IgE陽性的患者研究顯示，Der p10陽性率為15.2%；Der p10陰性者主要是Der p1和或Der p2陽性；而Der p10陽性者除了主要的變應(yīng)原(Der p1和Der p2)陽性外，其他屋塵螨組分也呈陽性。Der p10引起變態(tài)反應(yīng)癥狀的患者一般較少，但可通過檢測Der p10來確定屋塵螨過敏患者的臨床癥狀是否有與Der p10致敏有關(guān)。Der p10可能是除了Der p1和Der p2外，屋塵螨過敏患者體內(nèi)另1種與臨床癥狀相關(guān)的診斷標(biāo)記變應(yīng)原。Resch等[22]認(rèn)為，對這類患者進(jìn)行SIT時(shí)，需要注意其療效。

綜上，Der p1和Der p2是屋塵螨的主要致敏組分，且不同人群的反應(yīng)模式和分布也不同，也提示Der p1、Der p2 特異性IgE的臨床檢測在脫敏患者選擇和SIT監(jiān)控中有重要作用。Der p10不是屋塵螨的主要致敏組分，而是交叉反應(yīng)的主要致敏蛋白，提示Der p10可作為屋塵螨與其他變應(yīng)原存在交叉反應(yīng)的監(jiān)測致敏組分。

塵螨組分交叉反應(yīng)性

對于任一變應(yīng)原，其所含變應(yīng)原組分又可以分為特異性組分和交叉反應(yīng)性組分。所謂特異性變應(yīng)原組分基本上是指該變應(yīng)原所獨(dú)有的，僅能在有限的相關(guān)物種間中找到。如果對特異性組分過敏，則表示相應(yīng)的變應(yīng)原是引起臨床癥狀的主要原因。

粉塵螨和屋塵螨存在高度的交叉反應(yīng)性，絕大多數(shù)塵螨患者都是屋塵螨和粉塵螨共同致敏。目前，塵螨中被確認(rèn)的變應(yīng)原組分有20多種，并且根據(jù)其生化組成和同源性等分為多個(gè)組[29]。其中，Der p1組分屬于第1組，主要存在于屋塵螨排泄物中。Der p2組分屬于第2組，主要存在于屋塵螨體內(nèi)。Der p1和Der p2 被認(rèn)為是80%以上屋塵螨過敏患者的主要致敏組分[15，30]。粉塵螨第1組變應(yīng)原組分Der f1和Der p1可以誘導(dǎo)交叉反應(yīng)，而Der f2和Der p2幾乎完全交叉反應(yīng)[31-32]。Der p10為塵螨原肌球蛋白，Der f10和Der p10有98%的同源性[33]，廣泛存在于塵螨肌肉和非肌肉細(xì)胞中，它們存在交叉反應(yīng)的結(jié)論已確定。

熱帶無爪螨(Blomiatropicalis)存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)的塵土中。在新加坡和哥倫比亞，熱帶無爪螨浸液可輕度至中度抑制塵螨與其特異性IgE的結(jié)合，反之亦然。通過交叉免疫電泳發(fā)現(xiàn)，屋塵螨與熱帶無爪螨存在2至4種相似變應(yīng)原。通過點(diǎn)印跡抑制發(fā)現(xiàn)，Der p1、Der p2與熱帶無爪螨的變應(yīng)原交叉反應(yīng)性不高，F(xiàn)AST抑制實(shí)驗(yàn)、交叉免疫電泳/交叉酶免疫電泳表明，這兩種螨間的交叉反應(yīng)性為輕度至中度。重組的Blo t5與重組的Der p5僅有中度的免疫交叉反應(yīng)，Der p10與Blo t10之間的序列同源性為95%。因此，在熱帶和亞熱帶地區(qū)進(jìn)行螨檢查時(shí)，應(yīng)該注意檢查熱帶無爪螨。

Der p10蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與無脊椎動(dòng)物中的原肌球蛋白非常相似，如蝦，龍蝦，螃蟹，蟑螂和其他軟體動(dòng)物[34-35]。Der p10因其廣泛的交叉反應(yīng)性特點(diǎn)，除在螨蟲過敏患者中呈陽性，且在蟑螂、蝦蟹類和貝類食物的交叉過敏中也發(fā)揮重要作用。塵螨與蝦之間存在臨床相關(guān)的交叉反應(yīng)，與屋塵螨有交叉反應(yīng)的蝦過敏患者起碼對1種蝦過敏，而原肌球蛋白是起積極作用的變應(yīng)原。另外，在絲蟲感染的患者中也發(fā)現(xiàn)了Der p10特異性IgE和IgG[36]。塵螨與血吸蟲也有交叉反應(yīng)性，與其交叉反應(yīng)性相關(guān)的蛋白是副肌球蛋白和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶。蝸牛、甲殼動(dòng)物(如蝦)、蟑螂、衣魚和搖蚊和其他螨變應(yīng)原與塵螨變應(yīng)原間的交叉反應(yīng)已有免疫化學(xué)的研究證據(jù)[33]。在交叉反應(yīng)的抑制試驗(yàn)中，塵螨浸液是強(qiáng)烈的抑制因子，表明在致敏的變應(yīng)原中塵螨是主要的來源。塵螨變應(yīng)原和其他無脊椎動(dòng)物變應(yīng)原的交叉反應(yīng)可導(dǎo)致或加重食物過敏(如蝸牛、蝦等)。

結(jié)論與展望

對致敏蛋白組分特異性IgE檢測，可以明確特異性的致敏標(biāo)記物和交叉反應(yīng)性的標(biāo)記物，區(qū)分由交叉反應(yīng)或由共同致敏引起的變態(tài)反應(yīng)性疾病。通過確認(rèn)患者致敏組分變應(yīng)原可幫助臨床工作者評估變態(tài)反應(yīng)的臨床風(fēng)險(xiǎn)，區(qū)分變態(tài)反應(yīng)性疾病患者和因交叉反應(yīng)所致癥狀患者，進(jìn)而能夠?qū)ψ儜B(tài)反應(yīng)性疾病患者進(jìn)行SIT。

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