大白菜核不育雄蕊敗育超微結(jié)構(gòu)觀察

高宏秀,張 瑩

（江蘇徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇徐州 221006）

大白菜核不育雄蕊敗育超微結(jié)構(gòu)觀察

高宏秀,張 瑩

（江蘇徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇徐州 221006）

以大白菜雄性不育近等基因系為材料,運(yùn)用TEM技術(shù)進(jìn)行雄蕊發(fā)育過程中的絨氈層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究。結(jié)果顯示,在四分體時(shí)期,可育花藥絨氈層細(xì)胞開始橫向增大,細(xì)胞核清晰可見,核仁染色很深,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一致的囊泡；淀粉類物質(zhì)聚集成啞鈴形、球形等多種形狀。此時(shí)絨氈層細(xì)胞細(xì)胞膜較薄,細(xì)胞之間排列緊密；而同時(shí)期的不育花藥絨氈層開始膨大,出現(xiàn)許多小空泡,細(xì)胞膜明顯變厚,隨后絨氈層向藥腔伸展,出現(xiàn)多層細(xì)胞,有的細(xì)胞空泡化嚴(yán)重；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部未見細(xì)胞核和細(xì)胞器,也未見糖類物質(zhì)。有的細(xì)胞局部空泡化,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有少量的含油體和線粒體,由于糖類物質(zhì)較少,細(xì)胞質(zhì)比較清晰。說明絨氈層的結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致無法提供給小孢子發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì),最終導(dǎo)致雄蕊敗育。

大白菜；核不育；超微結(jié)構(gòu)觀察

雄性不育（malesterility,MS）是指植物在遺傳、環(huán)境（溫度和光照等因素）等因子的影響下雄性器官退化,發(fā)育不良或花粉、精子敗育不能夠行使生育能力而雌蕊卻發(fā)育正常的現(xiàn)象［1］。這種現(xiàn)象在植物界普遍存在。在高等植物中,約有43科162屬320種約620個(gè)品種或種間雜交種具有雄性不育現(xiàn)象［2-3］,并在新的科學(xué)技術(shù)手段的運(yùn)用過程中,創(chuàng)造了一批人工雄性不育體。雄性不育系主要是利用天然具有雜種優(yōu)勢(shì)的植株作為母本,省去人工去雄的煩瑣工作,便于大規(guī)模的雜交制種,為生產(chǎn)上大規(guī)模利用雜種1代優(yōu)勢(shì)創(chuàng)造有利條件,這樣不但能夠生產(chǎn)出具有較高純度的商業(yè)雜交種,還具有較強(qiáng)的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)功能。自1921年Bateson等首先在亞麻（Linumusitatissimum）中發(fā)現(xiàn)雄性不育以來,植物雄性不育機(jī)理的研究一直是一個(gè)熱門課題。

大白菜（BrassicacampestrisL.ssp.chinensis Makino）原產(chǎn)于我國北方地區(qū),是十字花科蕓薹屬蕓薹種葉用蔬菜,素有“菜中之王”的美稱,其栽培面積和消費(fèi)量在我國居各類蔬菜之首。大白菜為兩性花異花授粉,雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯。由于花器官比較小,單花結(jié)籽量很少,而單位面積的播種量又較大,人工授粉制種難以大面積地實(shí)現(xiàn)其雜種優(yōu)勢(shì)的商業(yè)化應(yīng)用。大白菜的遺傳背景比較簡(jiǎn)單,不育株和可育株僅受1對(duì)隱性基因控制,可在較短時(shí)間內(nèi)將顯性目的基因固定到雜交1代上,且F1代的營養(yǎng)器官是大白菜育種利用的主要部位,可不經(jīng)過育性恢復(fù)直接用于生產(chǎn),因此大白菜雄性不育系利用一直被認(rèn)為是目前F1代雜種生產(chǎn)的理想途徑。

關(guān)于核基因雄性不育系的遺傳機(jī)制的早期研究認(rèn)為,不育性是由核內(nèi)一對(duì)隱性基因控制,也有人提出是由1對(duì)顯性基因控制。通過測(cè)交篩選法發(fā)現(xiàn),這兩類不育材料都找不到完全的保持系,只能獲得不育株率穩(wěn)定在50%的兩用系。用兩用系配制商業(yè)雜交種,必須在開花前拔除可育株,增大了制種成本；在大面積制種時(shí),雜種純度難以保證。20世紀(jì)90年代,大白菜核基因雄性不育研究工作有了重大的突破。100%不育植株率的核不育材料選育成功,并對(duì)該類核不育材料的遺傳機(jī)制進(jìn)行摸索,獲得了一系列遺傳假說。

張書芳等［4］通過對(duì)小青口、二青幫、青幫河頭等品種的雜交篩選,獲得了不育株率穩(wěn)定在50%左右的不育系統(tǒng),但這種兩用系（既可作不育株也可作可育株）在生產(chǎn)應(yīng)用中面臨著不育株育性不穩(wěn)定的問題,需進(jìn)一步改良后才有可能應(yīng)用于生產(chǎn)。VanDerMeer等［5］在用大白菜品種Granaat和Pavchoi雜交的F1代中發(fā)現(xiàn)不育株,用Monument品種回交育成了顯性控制不育性的核不育材料。張書芳等［4］在農(nóng)家品種萬泉青幫中發(fā)現(xiàn)了顯性不育基因（Sp）及其顯性上位基因（Ms）,并找到了臨時(shí)保持系,育成了具有100%不育株率的雄性不育系88-1A。魏毓棠等［6］也獲得了類似的核不育體系。馮輝［7］等獲得雄蕊退化徹底、不育株率和不育度均為100%的復(fù)等位基因控制的大白菜核不育材料,并提出了大白菜核基因雄性不育“復(fù)等位基因遺傳假說”。該類不育系既不存在細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的胞質(zhì)負(fù)效應(yīng),也不存在制種時(shí)撥除可育株的問題,是一種較為理想的雄性不育系［8］。核不育花藥的細(xì)胞學(xué)研究主要就是為了研究花粉敗育的過程,這樣可將核不育分子水平研究和個(gè)體調(diào)控育性變化的研究聯(lián)系起來,有利于全面認(rèn)識(shí)核不育機(jī)理。

本研究以大白菜核不育近等基因系為材料,運(yùn)用電鏡超薄切片技術(shù)手段對(duì)材料花藥的發(fā)育進(jìn)行研究,預(yù)期獲得大白菜核不育花藥的確切敗育時(shí)間以及敗育特點(diǎn),并為大白菜核不育的細(xì)胞凋亡檢測(cè)提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大白菜核不育近等基因系L3,可育株基因型MsfMs,不育株基因型MsMs,遺傳穩(wěn)定,系統(tǒng)內(nèi)兄妹交后代育性保持1∶1分離,由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)大白菜課題組選育而成。

1.2 試驗(yàn)方法

透射電鏡切片觀察于盛花期,按花蕾在花序上的位置連續(xù)取樣,每樣設(shè)3個(gè)重復(fù),將材料迅速投入2.5%戊二醛固定液中固定。（1）前固定。50mmol·L-1pH值7.4的磷酸鈉緩沖液,含2.5%的戊二醛。室溫固定6h,磷酸鈉緩沖液漂洗3次,每次30min。（2）后固定。1%四氧化鈉,50mmol·L-1pH值7.4的磷酸鈉緩沖液中, 4℃固定12h,磷酸鈉緩沖液漂洗3次,每次30 min。（3）脫水。用30%,50%,70%,80%, 90%的酒精逐級(jí)脫水,每級(jí)20min,100%酒精脫水3次,每次30min。（4）滲透?；ㄋ幏旁诰凭脴渲瑸?∶1中,室溫下滲透2h；酒精：樹脂為1∶1中滲透5h；酒精∶樹脂為1∶2中滲透12h；純樹脂中滲透48h,中間換1次新鮮配制的樹脂。（5）包埋和聚合。用牙簽輕輕挑起花藥,然后放入預(yù)先裝滿包埋樹脂的包埋板上的小凹槽中,并使組織塊位于小凹槽的最右端,按照切片的要求調(diào)整組織塊的方向,在恒溫箱中60℃條件下聚合48h。（6）切片。用LeicaEMTRIM修塊機(jī)修快,在LeicaEMUC6超薄切片機(jī)上切片,厚度90nm,用75目銅網(wǎng)作載網(wǎng)撈取連續(xù)切片。（7）染色。醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛在室溫下雙染色各20min。（8）觀察。載網(wǎng)于JEM-1200EXⅡ型透射電鏡下80kV觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 可育花藥發(fā)育過程結(jié)構(gòu)觀察

通過前期對(duì)大白菜可育花藥的石蠟切片觀察,在四分體之前絨氈層細(xì)胞發(fā)育正常。進(jìn)一步用透射電鏡切片觀察大白菜核可育花藥雄蕊四分體時(shí)期至花粉成熟期絨氈層的結(jié)構(gòu)。

在四分體時(shí)期,隨著藥腔的發(fā)育,絨氈層細(xì)胞開始橫向增大,細(xì)胞核清晰可見,核仁染色很深,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不一致的囊泡；淀粉類物質(zhì)聚集成啞鈴形、球形等多種形狀。此時(shí)絨氈層細(xì)胞細(xì)胞膜較薄,細(xì)胞之間排列緊密（圖1中A,B）。在單核小孢子時(shí)期,絨氈層細(xì)胞已有局部橫向伸長,細(xì)胞質(zhì)清晰,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有液泡、小囊泡、淀粉粒等細(xì)胞器,細(xì)胞核染色較淺,核仁染色較深,液泡可見（圖1中C）。隨后絨氈層細(xì)胞縱向皺縮,橫向擴(kuò)張,發(fā)展成為細(xì)長型細(xì)胞,細(xì)胞開始出現(xiàn)大量的空泡化現(xiàn)象,細(xì)胞內(nèi)部的糖類物質(zhì)積累增多,細(xì)胞壁已經(jīng)不明顯,但是還存在明顯的細(xì)胞輪廓,同時(shí)細(xì)胞間隙也不斷加大（圖1中D）。最后在花粉即將成熟時(shí),絨氈層則降解明顯,絨氈層已經(jīng)沒有明顯細(xì)胞輪廓,絨氈層含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),細(xì)胞內(nèi)存在淀粉粒和核小體（圖1中E）,當(dāng)花粉完全成熟時(shí),絨氈層完全降解,花藥內(nèi)壁細(xì)胞成為一個(gè)空細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器都基本消失,細(xì)胞壁也變薄（圖1中F）。

2.2 不育花藥發(fā)育過程結(jié)構(gòu)觀察

通過前期對(duì)大白菜可育花藥的石蠟切片觀察,不育花藥的絨氈層在四分體時(shí)期異常發(fā)生,隨后進(jìn)一步用透射電鏡切片觀察大白菜核敗育花藥四分體時(shí)期至花粉成熟期絨氈層的結(jié)構(gòu)。

圖1 可育花藥超微結(jié)構(gòu)

圖2 不育花藥超微結(jié)構(gòu)

在四分體時(shí)期,藥絨氈層開始膨大,出現(xiàn)許多小空泡,細(xì)胞質(zhì)中可以看見小囊泡、含油體等細(xì)胞器,細(xì)胞核和核仁可見,但染色較淺,此時(shí)細(xì)胞壁明顯變厚（圖2中A）。隨后的小孢子向成熟期發(fā)育過程中,絨氈層向藥腔擴(kuò)增,出現(xiàn)多層細(xì)胞,有的細(xì)胞空泡化嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部已經(jīng)沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器了,也未見糖類物質(zhì)；而有的細(xì)胞局部空泡化,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有少量的含油體和線粒體等細(xì)胞器,但是糖類物質(zhì)較少,細(xì)胞質(zhì)比較清晰（圖2中B）。在小孢子發(fā)育后期,絨氈層細(xì)胞的空泡化更加嚴(yán)重,細(xì)胞被空泡占據(jù)大部分空間,細(xì)胞質(zhì)較少,可見個(gè)別線粒體,但其他細(xì)胞器和質(zhì)體已經(jīng)很難發(fā)現(xiàn)了,同時(shí)細(xì)胞也開始變得不規(guī)則,在接下來的發(fā)育中絨氈層也開始皺縮,細(xì)胞變得很不規(guī)則,細(xì)胞的細(xì)胞壁開始變薄,細(xì)胞內(nèi)部得高度空泡化,基本不具備活細(xì)胞的特征（圖2中C）。至花粉成熟期,絨氈層完全皺縮退化,已觀察不到絨氈層細(xì)胞了,此時(shí)花粉粒也降解完全,花藥全部敗育（圖2中D）。

3 小結(jié)與討論

絨氈層處于花藥結(jié)構(gòu)的最內(nèi)層,與小孢子直接接觸,所以絨氈層細(xì)胞對(duì)小孢子的形成和發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。對(duì)大多數(shù)植物而言,絨氈層的功能主要是產(chǎn)生和輸送給小孢子正常發(fā)育所必需的酶、生長素和營養(yǎng)物質(zhì)。從結(jié)構(gòu)水平來講,絨氈層的發(fā)育特征表現(xiàn)為順序的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的消除。絨氈層的分化及之后的退化與減數(shù)分裂后的花藥發(fā)育成熟相協(xié)調(diào)一致。從細(xì)胞水平來講絨氈層細(xì)胞是一種特殊的分泌細(xì)胞,絨氈層在小孢子母細(xì)胞完成減數(shù)分裂后能適時(shí)地分泌胼胝質(zhì)酶,分解四分體周圍的胼胝質(zhì)壁,促使其釋放小孢子。由于絨氈層合成與分泌胼胝質(zhì)酶具有時(shí)間和空間特異性,在有花植物花粉的正常發(fā)育中起著極其重要的決定作用。所以絨氈層的任何變化,都可能影響到小孢子的正常發(fā)育,從而導(dǎo)致雄性不育。正常的絨氈層細(xì)胞,在減數(shù)分裂時(shí)期細(xì)胞之間連接松弛,減數(shù)分裂結(jié)束后開始解體,隨著花粉的逐步成熟而逐漸退化,僅留殘片。絨氈層發(fā)生功能失常,常被認(rèn)為是花粉敗育的主要原因。如絨氈層提早成熟或解體、絨氈層增生或肥大、絨氈層不解體或推遲解體均可引起雄性不育。對(duì)本試驗(yàn)材料在電鏡切片中發(fā)現(xiàn),在四分體時(shí)期絨氈層開始膨大,出現(xiàn)空泡化,中層細(xì)胞開始退化,變成細(xì)長中空的細(xì)胞,細(xì)胞壁明顯變厚。隨后的小孢子向成熟期發(fā)育過程中,絨氈層向藥腔擴(kuò)增,出現(xiàn)多層細(xì)胞,有的細(xì)胞空泡化嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部已經(jīng)沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器了,也沒有糖類物質(zhì)；有的細(xì)胞局部空泡化,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有少量的含油體和線粒體等細(xì)胞器,但是糖類物質(zhì)較少,細(xì)胞質(zhì)比較清晰,這和可育性好的花藥同時(shí)期的結(jié)構(gòu)差異較大,最明顯的標(biāo)志就是供給小孢子發(fā)育的糖類物質(zhì)基本不存在,當(dāng)然也無法釋放給小孢子,所以絨氈層結(jié)構(gòu)的異常以及其部分功能的喪失,最終引起小孢子敗育。

大白菜核不育雄蕊敗育與花藥絨氈層細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān),絨氈層空泡化并異常膨大,細(xì)胞內(nèi)的囊泡、線粒體、糖類物質(zhì)都不斷減少,絨氈層提前解體,導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)不能運(yùn)輸?shù)叫℃咦又腥?小孢子不能繼續(xù)發(fā)育而最終敗育。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S634.1

B

0528-9017（2014）02-0197-03

文獻(xiàn)著錄格式：高宏秀,張瑩.大白菜核不育雄蕊敗育超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（2）：197-199,201.

2013-11-08

高宏秀（1980-）,江蘇泗陽人,講師,從事生物技術(shù)教學(xué)與研究工作。E-mail：575963188@qq.com。

張 瑩。