鹽酸?？颂婺釋CC-M細胞MMP-2、E-cadherin蛋白表達的影響

楊彩玲，韓金紅，王偉新，崔衛(wèi)剛*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院口腔外科，河南衛(wèi)輝453100;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，河南新鄉(xiāng)453003)

0 引言

鹽酸?？颂婺崾俏覈灾餮邪l(fā)的第一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑，可抑制人表皮細胞癌、胃腺癌細胞的生長增殖［1-2］，它能通過負性調控AKT信號通路抑制非小細胞肺癌的生長［3］，在體外可抑制人舌鱗癌Tca8113細胞的生長、增殖［4-5］，但是它對人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞的作用如何，還未見相關研究報道.筆者擬通過體外研究，探討該抑制劑對體外培養(yǎng)的人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞MMP-2、E-cadherin蛋白表達的影響，探討其是否可抑制ACC-M細胞的浸潤、轉移.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

細胞培養(yǎng)箱(美國，F(xiàn)orma公司)，流式細胞儀(德國，Partec公司).人癌細胞株ACC-M(人涎腺腺樣囊性癌細胞，上海，上海交通大學口腔醫(yī)學院)，鹽酸?？颂婺?杭州，浙江貝達藥業(yè)有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國，Gibco公司)，新生小牛血清(杭州，杭州四季青生物工程材料公司)，MMP-2、E-cadherin(美國，Santa Cruz公司)，通用型S-P超敏試劑盒、DAB試劑盒(北京，北京中杉金橋生物技術公司).

1.2 實驗方法

1)細胞培養(yǎng):人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞，將含有1.0×105U·L-1鏈霉素、1.0×105U·L-1青霉素，以及含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，放在溫度為37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液，當細胞貼壁生長密度達到80%左右時，傳代.

2)免疫細胞化學檢測:在6孔培養(yǎng)板內進行細胞爬片，當細胞生長后的密度大于1.0×108個·L-1時，按照0μmol·L-1和20μmol·L-1的濃度配制鹽酸?？颂婺崛芤海謩e加入相應標記孔中，放在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h.MMP-2與E-cadherin蛋白一抗工作液濃度均為1∶100，在陰性對照組里，用PBS液代替一抗工作液.嚴格按照說明書的染色步驟進行染色，并在光鏡下觀察結果:MMP-2蛋白與E-cadherin蛋白的陽性結果均表現(xiàn)為細胞質著棕黃色顆粒，它們的陰性結果均表現(xiàn)為不著色.

3)流式細胞儀檢測:在培養(yǎng)瓶中進行細胞的平行接種，當細胞生長后的密度大于1.0×108個·L-1時，按照0μmol·L-1、20 μmol·L-1的濃度配制鹽酸?？颂婺崛芤海謩e加入相應培養(yǎng)瓶中，使每1個培養(yǎng)瓶中抑制劑的作用時間達到48 h，收集細胞，加入-20℃的75%乙醇固定細胞.取單細胞懸液1.0×106個·L-1，加入鼠抗人單克隆抗體工作液0.1mL(MMP-21∶100;E-cadherin 1∶100)，采用室溫孵育，30min后進行PBS洗滌，加入100μL羊抗鼠FITCIgG二抗工作液，采用避光室溫孵育，30min后再進行PBS洗滌，加入0.1mL的PBS進行500目銅網(wǎng)的過濾后，上機檢測.蛋白表達定量分析用Fi(熒光指數(shù))表示，當 Fi＞1.0時，結果為陽性表達;當Fi≤1.0時，結果為陰性表達.實驗重復3次.

4)統(tǒng)計:應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)以表示，采用析因設計方差分析，檢驗水準α=0.05.

2 結果

2.1 免疫細胞化學染色

免疫化學染色表明:鹽酸?？颂婺嶙饔肁CC-M細胞后，MMP-2蛋白與E-cadherin蛋白的表達均發(fā)生變化.與參照組相對比，MMP-2蛋白細胞胞質染色陽性率明顯降低(見圖1);E-cadherin蛋白細胞胞質染色陽性率明顯增加(見圖2).

圖1 MMP-2蛋白的表達(SP，×400)

圖2 E-cadherin蛋白的表達(SP，×400)

2.2 間接免疫熒光流式定量檢測

間接免疫熒光流式定量檢測結果表明:0 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔肁CC-M細胞48 h后，MMP-2蛋白的XMode值為7.4±0.58，E-cadherin的 XMode值為7.9 ±0.64.20 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔肁CC-M細胞48 h后，MMP-2蛋白與E-cadherin蛋白的表達均發(fā)生變化.MMP-2蛋白的XMode值為5.7±0.43，E-cadherin的XMode值為 8.6 ±0.71.根據(jù) XMode值計算蛋白的FI值:MMP-2蛋白的FI值為0.967±0.001，E-cadherin蛋白的FI值為1.011±0.001.MMP-2蛋白呈陰性表達，E-cadherin蛋白呈陽性表達.

3 討論

細胞外基質和基底膜對維持細胞外基質蛋白結構的穩(wěn)定起著極其重要的作用.細胞間同質粘附力下降，或者細胞對細胞外基質的異質粘附力升高，均可導致腫瘤侵襲轉移的發(fā)生.證明基質金屬蛋白酶幾乎能降解細胞外基質的各種蛋白成分，在腫瘤細胞的浸潤轉移中具有關鍵性作用，其家族成員MMP-2由于定位于細胞穿透基質的突出部位，故最易和腫瘤細胞的侵襲生長發(fā)生關聯(lián)［6］.據(jù)相關實驗顯示，它在ACC-M(肺高轉移細胞株)中的表達高于ACC-2，表明ACC-M的肺高轉移能力可能與MMP-2的高表達有關［7］.本實驗用20 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔肕MP-2蛋白48 h，并分別對其進行免疫細胞化學檢測和流式細胞儀檢測，結果顯示，?？颂婺嶙饔煤?，MMP-2蛋白表達降低，呈現(xiàn)陰性表達.

E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，可通過細胞接觸抑制阻礙腫瘤細胞的去分化與惡性增殖，還可通過保持細胞黏附性，抑制腫瘤細胞的浸潤或轉移.E-cadherin蛋白在人類的許多腫瘤中如肺癌、口腔鱗狀細胞癌等表達異常［8-9］，表現(xiàn)為不表達或異位表達，表達強度與惡性腫瘤的組織分級呈負相關［9-10］.E-cadherin蛋白的表達可以預測酪氨酸激酶抑制劑的敏感性和臨床療效［11-12］.本實驗用20 μmol·L-1鹽酸?？颂婺嶙饔?E-cadherin 蛋白48 h，并分別對其進行免疫細胞化學檢測和流式細胞儀檢測，結果顯示，鹽酸埃克替尼作用后，E-cadherin蛋白表達增高，呈現(xiàn)陽性表達.

綜上所述，鹽酸?？颂婺嵬ㄟ^降低MMP-2蛋白的含量，增加E-cadherin蛋白的含量，可能抑制腫瘤的侵襲、轉移，但關于其中更深入的作用機制尚需進一步的深入研究.

［1］ Gao Zhenzhen，Chen Wei，Zhang Xiaohua，et al.Icotinib，a potent and specific EGFR tyrosine kinase inhibitor，inhibits growth of squamous cell carcinoma cell lineA431 through negatively regulatingAKT signaling［J］.Biomed Pharmacother，2013，67(5):351-356.

［2］Camidge D R.Icotinib:kick-starting the Chinese anticancer drug industry［J］.Lancet Oncol，2013，14(10):913-914.

［3］Shi Yuankai，Zhang Li，Liu Xiaoging，et al.Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer(ICOGEN):a randomised，double-blind phase 3 non-inferiority trial［J］.Lancet Oncol，2013，14(10):953-961.

［4］楊彩玲，韓新光.鹽酸?？颂婺釋θ松圜[狀細胞癌Tca8113細胞增殖的影響［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2008，43(4):701-703.

［5］楊彩玲，韓新光，于春亞.鹽酸埃可替尼對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞周期及CyclinD1、P27表達的影響［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2011，46(1):82-85.

［6］Taniwaki K，F(xiàn)ukamachi H，Komori K，et al.Stroma-derivedmatrixmetalloproteinase(MMP)-2 promotesmembrane type 1-MMP-dependent tumor growth inmice［J］.Cancer Res，2007，67(9):4311-4319.

［7］盧友光，周鴻鷹，丁林燦，等.涎腺腺樣囊性癌高、低轉移細胞系基因表達譜及基質金屬蛋白酶表達差異［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2006，23(5):505-510.

［8］Eimoneim H M，Zaghloul N M.Expression of E-cadherin，N-cadherin and snail and their correlation with clinicopathological variants:an immunohistochemical study of 132 invasive ductal breast carcinomas in Egypt［J］.Clinics(Sao Plaulo)，2011，66(10):1765-1771.

［9］Hashimoto T，Soeno Y，Maeda G，et al.Progression of oral squamouscellcarcinoma accompanied with reduced e-cadherin expression but not cadherin switch［J］.Plos One，2012，7(10):e47899.

［10］WellsA，Yates C，Shepard C R，et al.E-cadherin as an indicator ofmesenchymal to epithelial reverting transitions during themetastatic seeding of disseminated carcinomas［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25(6):621-628.

［11］Yauch R L，Januaro T，Eberhard DA，et al.Epithelial versusmesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2005，11(24):8686-8698.

［12］Witta S E，Gemmill R M，Hirsch F R，et al.Restoring Ecadherin expression increases sensitivity to epidermal growth factor receptor inhibitors in lung cancer cell lines［J］.Cancer Res，2006，66(2):944-950.