蛹蟲草基質(zhì)多糖對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

江海濤，吳雨龍，王仁雷，汪振炯，華 春,*

（1.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 21117 1；2.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南 京 210013）

蛹蟲草基質(zhì)多糖對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

江海濤1，吳雨龍1，王仁雷2，汪振炯1，華 春1,*

（1.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇 南京 21117 1；2.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南 京 210013）

目的：研究蛹蟲草基質(zhì)多糖（Cordyceps militaris stroma polysaccharides，CMSP）對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法：小鼠被隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組（150 mg/（kg·d））、CMSP各劑量組（150、300、600 mg/（kg·d）），連續(xù)灌胃30 d后，除空白對照組外，給予體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液建立小鼠急性肝損傷模型。12 h后，小鼠脫臼處死后取血液測定血漿中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、甘油三酯（tr i glyceride，TG）含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性，取肝臟、脾臟和胸腺計算其系數(shù)，并制備肝勻漿測定其中超氧化 物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、丙二醛（ malondialdehyde，MDA）和還原型谷胱甘肽（glutathione transferase，GSH）的含量，并觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果：CMSP各劑量組肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)，血漿中SOD活力、TG含量、ALT活性、AST活性，肝組織中SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量、GSH含量與模型組各水平相比均具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：蛹蟲草基質(zhì)多糖對酒精誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

蛹蟲草基質(zhì)多糖；酒精；急性肝損傷；保護(hù)作用

現(xiàn)在隨著人們生活水平的不斷提高，各式各樣的酒已成為餐桌上必不可少的角色，伴隨而來的是肝臟負(fù)擔(dān)越來越重。肝臟是機(jī)體內(nèi)酒精代謝的主要器官，過量酒精的攝入會使肝臟受到不同程度的損傷。機(jī)體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，使三羧酸循環(huán)產(chǎn)生障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝。乙醇中毒可以直接引起肝臟纖維化，并由肝纖維化直接進(jìn)入肝硬化[1]。酒精性肝病已經(jīng)成為我國的第二大肝臟疾患，目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗氧化藥物谷胱甘肽和水飛薊素雖然能夠消除酒精所致的氧化應(yīng)激，然而這類的抗氧化物質(zhì)卻不能有效地改善酒精性脂肪性肝炎的癥狀[2]。因此開發(fā)安全有效的能夠預(yù)防酒精性肝病的藥物非常重要。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又名北冬蟲夏草或北蟲草，隸屬于子囊菌門、麥角菌科、蟲草屬的真菌。經(jīng)研究，蛹蟲草富含多種功能活性物 質(zhì)，如蟲草素、蟲草多糖、以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等[2-3]，與冬蟲夏草有相似的活性成分和藥理作用[4]，且人工培養(yǎng)技術(shù)成熟。蛹蟲草可采用蠶蛹、大米、小麥等培養(yǎng)基人工栽培[5]，但栽培后的廢基質(zhì)大都沒有得到有效利用，而廢基質(zhì)中的多糖含量約為子實體的2～4倍[6]。大量研究[7-10]證實蛹蟲草子實體多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、保肝等作用，能提高免疫力，延緩衰老等，而關(guān)于蛹蟲草基質(zhì)多糖（Cordyceps militaris stroma polysaccharides，CMSP）對小鼠急性酒精性肝損傷的研究尚未見報道，本實驗探究CMSP對酒精所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，為提高蛹蟲草人工栽培的附加值和研制開發(fā)保健食品或天然藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草基質(zhì)多糖（CMSP）由南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院食品工程研究室提供。

雄性ICR小白鼠，動物合格證號：SCXK（蘇）2012-0004，體質(zhì)量18～25 g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST/GOT）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT/GPT）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、SOD WST-1法測定試劑盒、蛋白定量測試盒、微量還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒 北京北化康泰臨床試劑有限公司；其他試劑均 為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA3003N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；W5000洗板機(jī)、MR5000酶標(biāo)儀 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；F6/10勻漿器YK0507603上海尤釋機(jī)電設(shè)備發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CMSP的制備

稱取5 g蛹蟲草廢基質(zhì)粉末，加入200 mL水，搖勻，再加入2 000 u的纖維素酶2.5 mL，調(diào)節(jié)pH值到4.8，在50 ℃水浴1.5 h，再轉(zhuǎn)移到80 ℃水浴中滅活2 h，然后再進(jìn)行超聲波處理，30 ℃處理40 min，在4 200 r/min離心10 min，收集上清糖液。將收集到的糖液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到一定體積，采用Sevag法進(jìn)行除蛋白，除蛋白后的糖液采用4 倍體積的95%的乙醇進(jìn)行醇沉，在4 ℃冰箱中醇沉24 h，經(jīng)抽濾，冷凍干燥得CMSP。

1.3.2 酒精誘導(dǎo)肝損傷動物模型的建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、陽性對照組（聯(lián)苯雙酯150 mg/（kg·d））、CMSP各劑量組（150、300、600 mg/（kg·d）），每組15 只。受試樣品用蒸餾水配制，各實驗組小鼠按順序每天灌胃受試樣品1 次，連續(xù)灌胃30 d，實驗期間供給全價顆粒飼料，不限制飲食飲水。實驗至第31天，各組小鼠禁食不禁水12 h后，陽性對照組、實驗組及模型組以12 mL/kg的量，用50%體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液按順序灌胃，建立小鼠急性肝損傷模型，空白對照組灌予等體積的蒸餾水。各組均于末次給藥后禁食不禁水。

1.3.3 一般情況觀察

實驗期間觀察小鼠的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度、死亡等情況，并記錄。

1.3.4 指標(biāo)測定

各組小鼠禁食16 h后，去除死亡小鼠，按原先給藥順序各組取10 只小鼠摘眼球采血，分離血漿，備測；并快速脫臼處死小鼠，取肝臟、脾臟和胸腺分別稱質(zhì)量，分別計算肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)；取備血漿適量測定其中ALT、AST、SOD酶活力和TG；準(zhǔn)確稱取肝臟相同部位0.5 g，以1∶9（m/V）的生理鹽水制成肝勻漿[11-14]。按試劑盒說明書方法分別測定肝組織中SOD、GSH-Px活力和MDA、GSH含量。

1.3.5 肝組織病理切片制作

取小鼠右葉相同位置肝組織，用4 ℃生理鹽水沖盡殘血，濾紙拭干，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況觀察及死亡率

給予50%乙醇溶液后，小鼠先表現(xiàn)出興奮狀態(tài)，繼而行走不穩(wěn)，四肢癱軟，30 min后重者嗜睡、醉倒、呼吸急促、抽搐，此狀態(tài)一直持續(xù)1 h左右。12 h后模型組小鼠普遍狀態(tài)不好，精神萎靡不振，毛色干枯無光澤，活動減少。由表1可知，除空白對照組和高劑量組外，每組皆有小鼠死亡，死亡時間大都集中在造模開始后的數(shù)小時內(nèi)。與模型組相比，陽性對照組、CMSP組小鼠對酒精所致急性肝損傷死亡時間有所延長，死亡數(shù)有所減少，精神狀態(tài)和毛色、光澤有著顯著改善，而且CMSP中、高劑量組小鼠較低劑量組、陽性對照組小鼠，存活率高、死亡時間延長。這說明CMSP對酒精所致急性肝損傷有一定的保護(hù)作用，且存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表1 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠死亡的影響Table 1 Effect of CMSP on the mortality of mice with acute alcohol induced liver injury

2.2 指標(biāo)檢測結(jié)果

2.2.1 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)的影響

表2 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠肝臟、脾臟及胸腺指數(shù)的影響Table 2 Effect of CMSP on the liver index, spleen index and thymus index of mice with acute alcohol induced liver injury

由表2可知，空白對照組、陽性對照組及CMSP各劑量組與模型組比較肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)均有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）；除CMSP高劑量組及中劑量組脾臟指數(shù)外，與空白對照組比較，各實驗組肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)也均有顯著性差異（P＜0.05）。提示CMSP能改善肝脾的脂質(zhì)代謝，抑制脂質(zhì)在肝脾內(nèi)的沉積，同時對胸腺具有一定的保護(hù)作用。

2.2.2 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠血漿中ALT、AST、SOD活力和TG含量的影響

表3 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠血漿中ALT、AST、SOD活力和TG含量的影響Table 3 Effect of CMSP on serum levels of ALT, AST, SOD and TG in mice with acute alcohol induced liver injury

由表3可知，模型組小鼠血漿中的ALT、AST 活性與TG含量極顯著的高于空白對照組（P＜0.01），且SOD的活性極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。與模型組相比，CMSP各劑量組與陽性對照組的ALT、AST活性與TG含量的下降及SOD活性的上升均達(dá)到了顯著水平（P＜0.05或P＜0.01），且CMSP的高劑量組的ALT、AST 活性與TG含量的下降水平均低于陽性對照組，且SOD活性的上升水平高于陽性對照組。肝臟受損時，會引起血漿中ALT、AST升高，TG含量的增加，SOD活性的降低，提示CMSP具有較好的保護(hù)肝臟受損、降低血漿轉(zhuǎn)氨酶的能力。

2.2.3 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠肝勻漿中SOD、GSH-Px活力及MDA、GSH含量的影響

表4 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠肝勻漿中SOD、GSH-Px活力及MDA、GSH含量的影響Table 4 Effect of CMSP on SOD and GSH-Px activities and MDA and GSH levels in the liver of mice with acute alcohol induced liver injury

由表4可知，與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力、GSH含量顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，CMSP高劑量組的SOD、GSH-Px活力、MDA和GSH含量有極顯著差異（P＜0.01），且優(yōu)于陽性對照組；CMSP低、中劑量組的SOD、GSH-Px活力、MDA和GSH含量有顯著差異（P＜0.05），且低、中劑量組的GSH含量優(yōu)于陽性對照組。提示CMSP具有較好的改善肝組織過氧化的能力。

2.3 CMSP對酒精所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化影響

圖1 CMSP對酒精致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化影響（HE, ×400）Fig.1 Effect of CMSP on hepatic histopathological change in mice with acute alcohol induced liver injury(HE staining, × 400）

由圖1可知，空白對照組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，具有正常的中央靜脈且無嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象，肝細(xì)胞完整，肝細(xì)胞胞漿均勻，核仁清晰（圖1A）。酒精模型組小鼠的肝臟切片中則發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞腫大，胞漿疏松，細(xì)胞核固縮較嚴(yán)重，脂肪空洞，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象（圖1B）。CMSP低劑量和陽性對照組較模型組癥狀減輕，脂肪空泡減少，中劑量組除了血管周圍少量肝細(xì)胞腫脹之外，肝細(xì)胞排列較整齊，而高劑量組接近空白對照組。提示CMSP對酒精致急性肝損傷有較好的保護(hù)作用。

3 討 論

平時飲用的酒中最主要的成分是乙醇，乙醇被機(jī)體吸收后在肝臟內(nèi)代謝會產(chǎn)生大量的自由基，過量的自由基將會導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起肝細(xì)胞的損傷[15-16]。其損傷表現(xiàn)為細(xì)胞器結(jié)構(gòu)上的破壞和細(xì)胞膜膜流動性失常，從而導(dǎo)致清除自由基的酶消耗增加，肝代謝紊亂以及脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞的壞死[17-18]。體內(nèi)自由基代謝平衡主要是通過機(jī)體抗氧化酶來維持，主要包括SOD、GSH和GSH-Px等，通過測定SOD、GSH和GSH-Px活性可直接反映機(jī)體抗氧化功能狀態(tài)。SOD 是一種廣泛分布于各種生物體內(nèi)，是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一以自由基為底物的酶，能將O2－·歧化為H2O2和O2，是機(jī)體內(nèi)對抗自由基的第一道防線[19]，且可與GSH-Px協(xié)同作用防止脂質(zhì)過氧化及其代謝產(chǎn)物對機(jī)體的損害。因此其活力與含量反映了機(jī)體清除自由基的能力。GSH 廣泛存在于人體的各種組織中，GSH 水平降低意味著機(jī)體抗氧化能力下降，并引發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基。在肝臟化學(xué)性損傷時，氧化應(yīng)激消耗GSH引起肝臟GSH含量下降，機(jī)體抗氧化能力下降并引發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。GSH-Px是一種含硒的廣泛存在于細(xì)胞線粒體、胞漿內(nèi)以及生物膜上的水溶性四聚體蛋白酶，可通過特異性催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，對由活性氧和羥自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物及過氧化氫有極強(qiáng)的清除能力，從而保護(hù)細(xì)胞免受自由基損害。其含量的高低也反映了機(jī)體清除自由基的能力[21-22]。ALT和AST是動物血清中兩種重要的轉(zhuǎn)氨酶。正常時，ALT和AST在血清中的含量為零或很少，但當(dāng)肝臟受到損害時，肝細(xì)胞不能維持其結(jié)構(gòu)的完整性，ALT和AST就會滲透進(jìn)入血液，所以，ALT和AST活性的改變是肝臟受到損害的一種應(yīng)答反應(yīng)[23]，當(dāng)檢測到血清中的ALT和AST活性升高時即可表明其肝臟的正常功能受到破壞。所以血清中這兩種酶活性的增高及增加的幅度在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害的程度。TG是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。人體內(nèi)的TG主要在肝臟中合成，肝臟可利用糖、甘油和脂肪酸作原料，通過磷脂酸途徑合成TG。若肝臟受到損傷，則會導(dǎo)致機(jī)體對游離脂肪酸的動員利用減少，血中游離脂肪酸水平上升，導(dǎo)致血清中TG水平升高，易引起高甘油三酯血癥。所以血清中TG含量的高低間接反映了肝臟受損的程度[24]。MDA是脂質(zhì)過氧化降解的主要產(chǎn)物，MDA 能使膜蛋白、酶發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，使膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生改變，對機(jī)體造成損害，其含量反映了組織脂質(zhì)過氧化損傷程度。MDA含量的高低也間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[25-26]。因而，檢測血清中ALT、AST、SOD活性與TG的含量及肝組織中SOD、GSH-Px活性、GSH、MDA含量是評價肝損傷的重要指標(biāo)。

實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，酒精致急性肝損傷模型組的肝、脾、胸腺指數(shù)及各生化指標(biāo)均有顯著性的改變，說明本實驗建立的急性肝損傷模型成功。據(jù)報道，蛹蟲草子實體多糖能提高免疫抑制小鼠模型的免疫功能和抗氧化、清除自由基以及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，顯著增強(qiáng)內(nèi)源性SOD、GSH、GSH-Px 等抗氧化酶水平和總抗氧化能 力，降低MDA水平[27]。本實驗中，CMSP各劑量組不同程度降低了酒精致急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST、TG的含量，SOD活性升高，這與Yu Rongmin等[28]研究的結(jié)果相一致，說明蛹蟲草基質(zhì)多糖和蛹蟲草子實體多糖有相似的功效，可以通過抵抗酒精所致的小鼠急性肝損傷，減少肝細(xì)胞中ALT、AST 釋放到血清中的量，降低血清中TG含量，提高血清中SOD的含量從而對細(xì)胞膜的完整性也有良好的保護(hù)作用。另外，本實驗中，CMSP各劑量組可使致急性肝損傷小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、GSH活性的上升和MDA含量的降低，進(jìn)一步說明蛹蟲草基質(zhì)多糖和蛹蟲草子實體多糖有相似的功效，可提高機(jī)體SOD、GSH-Px和GSH活力，及時清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基，避免活性氧自由基在體內(nèi)的大量積累，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成，在抗脂質(zhì)過氧化損傷方面了積極的作用。病理組織學(xué)觀察到的組織病理切片可以看出，CMSP能不同程度地減輕肝組織的病理損傷和炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定細(xì)胞膜，起到保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，蛹蟲草基質(zhì)多糖對酒精致小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，在食品保健和治療藥物方面很有開發(fā)前景。

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Protective Effect of Polysaccharides from Cordyceps militaris Stroma against Alcohol-Induced Acute Liver Injury in Mice

JI ANG Hai-tao1, WU Yu-long1, WANG Ren-lei2, WANG Zhen-jiong1, HUA Chun1,*
(1. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang University, Nanjing 211171, China; 2. School of Life Science and Chemistry, Jiangsu Second Normal University, Nanjing 210013 , China)

Objective: To explore the protective effect of Cordyceps militaris stroma polysaccharides (CMSP) on alcoholinduced acute liver injury in mice. Methods: Mice were randomly divided into blank control, alcohol-induced liver injury model, positive control and CMSP treatment groups (at doses of 150, 300 and 600 mg/(kg·d)) groups. After 30 consecutive days of intragastric a dministration, all mice except for blank control group were given by gavage 50% alcohol at a dose of 12 mL/kg to induce acute liver injury. At 12 h after alcohol administration, all the mice in each group were killed by cervical dislocation and their bloods were collected for the measurement of superoxide dismutase (SOD), alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) activities and triglyceride (TG) content in the serum. Moreover, the liver, spleen and thymus were collected to calculate the coefficients. The activities of SOD and glutathione peroxidase (GSH-Px) as well as the levels of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) in liver homogenate were measured, and pathological changes in liver tissue were observed. Results: The liver, spleen and thymus coefficients, serum SOD, ALT a nd AST activities and TG content, and the contents of MDA and GSH in the liver of mice from the CMSP groups were significantly different from those of the liver injury control group (P ＜ 0.05 or P ＜ 0.01). Conclusion: CMSP has a significant hepatoprotective effect on alcohol-induced acute liver injury in mice.

Cordyceps militaris stroma polysaccharides; alcohol; acute liver injury; protection

TS201.2

A

1002-6630（2014）13-0223-05

10.7506/spkx1002-6630-201413043

2013-08-24

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2012AA021701）；國家自然科學(xué)基金面上項目（21376112）；江蘇省大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目（2013015）；南京曉莊學(xué)院重點應(yīng)用項目（2012NXY08）

江海濤（1980—），男，講師，碩士，研究方向為活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。E-mail：849673387@qq.com

*通信作者：華春（1963—），女，教授，本科，研究方向為植物生理生化。E-mail：hc3501988@163.com