高效液相色譜法測定辣椒粉中堿性橙的不確定度評定

張金艷，胡麗芳，李偉紅，郭孝培，羅林廣

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標準研究所，江西 南昌 330200）

高效液相色譜法測定辣椒粉中堿性橙的不確定度評定

張金艷，胡麗芳，李偉紅，郭孝培，羅林廣*

（江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標準研究所，江西 南昌 330200）

為分析高效液相色譜法測定辣椒粉中堿性橙含量的不確定度，采用JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》進行評定。依據(jù)檢測方法建立數(shù)學(xué)模型，分析不確定度的重要來源，其中標準溶液配制產(chǎn)生的不確定度是0.008 3，最小二乘法擬合標準曲線校準產(chǎn)生的不確定度是0.056，樣品稱量帶來的不確定度是0.002 5，樣品定容帶來的不確定度是0.005 0，樣品處理過程帶來的不確定度是0.012，結(jié)果的重復(fù)性帶來的不確定度是0.022。對各不確定度分量進行分析計算和合成不確定度，通過乘以95%概率下的擴展因子2，獲得加標辣椒樣品中堿性橙含量測定結(jié)果是（30±3.73） mg/kg，最小二乘法擬合標準曲線對測定結(jié)果的影響最大，其次樣品處理過程和結(jié)果的重復(fù)性帶來的不確定度也不容忽略。

高效液相色譜法；辣椒粉；堿性橙；不確定評定

堿性橙是一種偶氮類堿性工業(yè)染料，俗名王金黃[1]。主要用于棉制品、絲制品及其皮革等物品的印花和染色[2]。根據(jù)美國衛(wèi)生研究所化學(xué)品安全與健康數(shù)據(jù)庫資料表明：攝取、吸入、以及皮膚接觸該物質(zhì)，均會發(fā)生急性和慢性中毒傷害[3-4]。該染料堿性條件下與蛋白質(zhì)有較強的吸附作用，比食用色素更易給食品染色，染色后色澤鮮艷且不易褪色，價格又較低廉，因此常被一些不法食品加工商用來對辣椒制品等食品進行染色[5-10]，該染料具有致畸性和致突變性[11-15]，危害到人體健康，被嚴禁作為食品添加劑使用[16-17]。

測量結(jié)果的不確定度是評價一種測量方法能力優(yōu)劣的指征，并與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[18-20]，它能對檢測數(shù)據(jù)進行客觀真實的評價，給出測量結(jié)果的可信程度[21-22]。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法是檢測食品中堿性橙常用的方法，在其分析過程中操作步驟比較復(fù)雜，影響因素較多，因此給出具有置信概率的檢測結(jié)果，掌握對檢測結(jié)果有較大影響的關(guān)鍵因素，是實施內(nèi)部質(zhì)量控制的重要工作內(nèi)容，本實驗根據(jù)GB/T 23496—2009《食品中禁用物質(zhì)的檢測：堿性橙染料：高效液相色譜法》[23]對采用HPLC法測定辣椒粉中的堿性橙過程中的不確定度來源進行全面分析，并最終給出評定結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

辣椒粉 市購；堿性橙（99%） 阿達瑪斯試劑有限公司；甲醇、乙醇、乙酸銨（均為優(yōu)級純） 德國Merck公司。

2690型液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器）美國Waters公司；FA1104N電子天平 上海天平儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 測試過程

樣品處理過程及HPLC條件按GB/T 23496—2009《食品中禁用物質(zhì)的檢測：堿性橙染料：高效液相色譜法》執(zhí)行[23]，辣椒粉試樣中的堿性橙用無水乙醇提取、濃縮、定容，HPLC-紫外檢測器測定，外標法定量。稱取20.0 g樣品，置于50 mL離心管中，加5 g無水硫酸鈉，25 mL無水乙醇超聲提取30 min，3 000 r/min、離心10 min，將上層提取清液置于離心管中，再次加入10 mL無水乙醇，重復(fù)提取3 次，合并提取液，3 000 r/min、離心10 min，將上層提取清液傾倒于圓底燒瓶中，于40 ℃減壓濃縮至近干，用無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移到刻度試管中，在50 ℃條件下氮氣吹干，定容至2 mL；濾膜過濾后待進樣。采用C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-（20 mmol/L）乙酸銨（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

1.2.2 建立數(shù)學(xué)模型

式中：ω為樣品中堿性橙染料的含量/（mg/kg）；C為從標準曲線得到的堿性橙的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為樣品的最終定容體積/mL；m為樣品的質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量的主要來源及其分項評定

從測量方法可以看出，引入不確定因素主要有標準溶液的配制、標準曲線的校準、樣品稱量、樣品定容、樣品的處理過程、結(jié)果的重復(fù)性等，且數(shù)學(xué)模型都是積和商的模型，同時各影響因素相互獨立，則合成的標準不確定度表征為：

2.1.1 標準溶液配制產(chǎn)生的不確定度分析

堿性橙標準溶液的計算公式（3）所示：

式中：m為堿性橙標準品的質(zhì)量/g；P為堿性橙標準品的純度（99±1）%；V100為100 mL容量瓶的體積/mL；f為稀釋因子；Cstd為堿性橙標準溶液的質(zhì)量濃度/（g/mL）。

則合成標準不確定度為：

2.1.1.1 標準品稱量引入的不確定度

天平稱量重現(xiàn)性屬于A類不確定度，根據(jù)檢定證書，實驗用FA1104N電子天平的不確定度為0.1 mg，包含因子k=2，因此引入的不確定度為：

2.1.1.2 標準品純度引入的不確定

堿性橙純度按照其試劑瓶上的標簽給出的含量為（99±1）%，按照B類不確定度進行評定，不確定度半寬A1=1%，可認為服從均勻分布，則：

2.1.1.3 配制100 mL標準品溶液體積的不確定度

100 mL容量瓶的標準不確定度來源有容量瓶的校準、重復(fù)性、溫度的變化及其人員的讀數(shù)。

1）容量瓶校準引入的不確定度，根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[24]給出100 mL容量瓶（A）級容量允差為（±0.1）mL，容量允差包括體積校準、重復(fù)性和人員讀數(shù)，按照均勻分布進行B類不確定度評定為：

2）溫度引入的不確定度，使用溫度與校正溫度之間的差異會引入不確定度分量，甲醇的體積膨脹系數(shù)為14.3×10—4℃，實驗室室溫在（±5）℃之間變動，按照均勻分布進行B類不確定度評定，則溫度差異引入的不確定度為：

2.1.1.4 稀釋過程稀釋因子帶來的不確定度

采用最小二乘法計算溶液中的質(zhì)量濃度，使用最小二乘法擬合的前提是假定做工作曲線的標準溶液質(zhì)量濃度的不確定度的影響可以忽略，故稀釋過程只考慮10 mL的移液管和100 mL的容量瓶。2種稀釋方法的標準不確定度來源有校正、重復(fù)性、溫度、讀數(shù)。10 mL的移液管的標準不確定度來源為：

1）根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定，10 mL的移液管容量允差為±0.020 mL，按照均勻分布進行B類不確定度評定，則：

2）溫度引入的不確定度參見2.1.1.3節(jié)公式（8），則：

3）100 mL容量瓶引入的不確定度與分析2.1.1.3節(jié)相同，Urel（V100）=0.004 168。

1∶100稀釋使用10 mL的移液管和100 mL的容量瓶來完成，則：

則堿性橙標準溶液的相對標準不確定度為：

2.1.2 最小二乘法擬合標準曲線校準產(chǎn)生的不確定度

為校準液相色譜儀，采用6 個質(zhì)量濃度水平的堿性橙標準工作液，得到相應(yīng)的峰面積A，用最小二乘法擬合得直線方程A=32.8C＋0.7，相關(guān)系數(shù)r2=0.996。該過程不確定度的評定同樣屬于A類不確定度評定，本次評定對樣品溶液進行了6 次測量，具體詳見表1。

表1 最小二乘法擬合標準曲線數(shù)據(jù)Table1 Experimental data for the calibration curve created by linear least squares fitting

堿性橙的標準不確定度計算過程如下：

式中：SR為回歸曲線的剩余標準差；A0i為各標準液的實際峰響應(yīng)值；a＋bC0i為根據(jù)回歸曲線計算出來的理論值；n為回歸曲線的點數(shù)；p為待測樣品的重復(fù)測定次數(shù)；為待測樣品質(zhì)量濃度的平均值；為回歸曲線的各點質(zhì)量濃度的平均值；C0i為各標準液質(zhì)量濃度。

2.1.3 樣品稱量帶來的標準不確定度

樣品稱量帶來的相對標準不確定度分析與2.1.1.1節(jié)相同。

2.1.4 樣品定容帶來的標準不確定度

樣品定容用1 mL的可調(diào)移液器，則來源有校準、重復(fù)性、溫度、人員讀數(shù)。

1）根據(jù)JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》規(guī)定，1 mL的可調(diào)移液器吸取1 mL容量允差為（±1.0）%，容量允差包括體積校準、重復(fù)性和人員讀數(shù)，按照均勻分布進行B類不確定度評定。

2）溫度引入的不確定度，按照均勻分布進B類不確定度評定，參見2.1.1.3節(jié)，則：

2.1.5 樣品處理過程差異帶來的標準不確定度

樣品測試的回收率，主要取決于取樣的均勻性、操作人員的熟練程度、提取效率等多種因素，采用A類方法進行評定，按標準方法做了加標回收率，對加標辣椒樣品（加標量為30 mg/kg）進行重復(fù)6 次測定，其結(jié)果回收參數(shù)見表2，樣品處理過程帶來的標準不確定度。

表2 樣品回收率測定參數(shù)Table2 Spiked recoveries

2.1.6 結(jié)果的重復(fù)性帶來的不確定度

在重復(fù)性條件下，對樣品進行了6 次獨立的測試，測得辣椒粉中堿性橙含量的標準不確定度分析按照A類不確定度進行評定：

則6 次添加檢測結(jié)果ω 1～6分別為25.8、27.4、26.0、27.0、26.3、27.7 mg/kg；為26.7 mg/kg，則urel（）= 0.022。

2.2 計算合成不確定、擴展不確定度及報告不確定度

因各不確定度分量相互獨立，故加標辣椒樣品中堿性橙測定結(jié)果的合成的標準不確定度為：

則合成不確定度為U（CX）=ω×Urel（CX）= 1.863 mg/kg。在置信概率為95%，包含因子k=2，則擴展不確定度為k×U（CX）=3.73 mg/kg，因此本實驗加標辣椒樣品中的堿性橙殘留量的測定結(jié)果為（30±3.73）mg/kg。

2.3 評定結(jié)果分析

圖1 各分量不確定度直方圖Fig.1 Histogram of relative uncertainty components

由圖1可以看出，在重復(fù)性實驗條件下測定辣椒粉中的堿性橙時，urel（C）、urel（frep）、urel（）是造成測定結(jié)果不確定度的主要分量，其中樣品稱量和樣品定容過程所帶來的不確定度可忽略不計，而擬合標準工作曲線（峰面積）引入的不確定值最大。要降低這一貢獻值，首先在實際的測定過程中，嚴格控制影響外標法定量和重復(fù)測量過程中的各種影響因素，如保證儀器處于最佳的狀態(tài)，待在基線相當平穩(wěn)以后進行，從而獲得最好的測量結(jié)果，此外在檢測的過程中應(yīng)盡量提高實驗結(jié)果的平行性，以保證結(jié)果的準確可靠。

3 結(jié) 論

HPLC法測定辣椒粉中堿性橙含量的不確定度的貢獻從大到小依次是最小二乘法擬合標準曲線帶來的不確定度，結(jié)果的重復(fù)性測定帶來不確定度、樣品處理過程帶來不確定度、標準溶液配制帶來的不確定、樣品定容過程帶來的不確定度、樣品稱量過程帶來的不確定度。

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Uncertainty Evaluation for the Determination of Basic Orange in Chili Powder by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Jin-yan, HU Li-fang, LI Wei-hong, GUO Xiao-pei, LUO Lin-guang*
(Key Laboratory of Quality and Safety of Agricultural Products, Agricultural Product Quality Safety and Standards Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China)

Based on Evaluation of Uncertainty in Chemical Analysis Measurement, the uncertainties in the determination of basic orange in chili powder by HPLC were evaluated. According to the developed mathematic model, the sources of uncertainty were analyzed. The uncertainty components affecting the results were evaluated. The uncertainties from the preparation of standard solution, the calibration of the standard curve fitted by least square regression, the measurement of the sample weight, the adjustment of the sample volume, sample treatment, and the repeatability of the results were 0.008 3, 0.056, 0.002 5, 0.005 0, 0.012, and 0.022, respectively. The content of basic orange in spiked chili powder was (30 ± 3.73) mg/kg as obtained by multiplying the combined uncertainty from the uncertainty components by the expansion factor 2 at 95% possibility. It was also found that the uncertainty from the standard curve fitted by least square regression had the largest effect on the results, and the uncertainties from sample treatment and the repeatability of the results could not be overlooked.

high performance liquid chromatography; chili powder; basic orange; uncertainty evaluation

O06；TS207.3

A

1002-6630（2014）20-0213-04

10.7506/spkx1002-6630-201420042

2014-01-21

江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新基金（青年基金）項目（2012CQN007）

張金艷（1982—），女，助理研究員，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測分析技術(shù)。

E-mail：zhangjinyana@126.com

*通信作者：羅林廣（1964—），男，研究員，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與風險評估。E-mail：luolinguang@126.com