IPTG與乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)

李攀峰，張洪斌，胡雪芹

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院制藥工程系，安徽 合肥 230009）

IPTG與乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)

李攀峰，張洪斌*，胡雪芹

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院制藥工程系，安徽 合肥 230009）

研究異丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）與乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)的效果。在利用IPTG和乳糖分別作為誘導(dǎo)劑對(duì)右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET28-dexYG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的基礎(chǔ)上，嘗試將此兩種誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用，在降低成本的同時(shí)獲得較好的表達(dá)效果。在獲得最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，考察菌體IPTG與乳糖的聯(lián)合加入量、菌體濃度、誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)的影響。在菌濃（OD600nm）達(dá)到3.0時(shí)，加入0.1 mmol/L IPTG 95 μL+2.5 g/L乳糖，25℃混合誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，酶活力最高，達(dá)到40.44 U/mL。IPTG與乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)重組大腸桿菌右旋糖酐蔗糖酶表達(dá)可行。

異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；乳糖；右旋糖酐蔗糖酶；表達(dá)；聯(lián)合誘導(dǎo)

右旋糖酐蔗糖酶（dextransucrase，DSR，EC2.4.1.5）屬于糖苷水解酶第70家族，是一種葡聚糖蔗糖酶（又稱(chēng)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，glucosyhransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)GTF），是葡聚糖蔗糖酶領(lǐng)域中研究較早較熱門(mén)的一類(lèi)酶[1-2]。該酶的催化是以蔗糖為底物，切斷D-葡萄糖基與果糖基的糖苷鍵，并形成D-葡萄糖基與酶的復(fù)合物，釋放出果糖，然后將葡萄糖基單元以α-1,6或其他糖苷鍵的形式連接起來(lái)，生成兩類(lèi)重要產(chǎn)品：右旋糖酐和果糖[3]。

果糖在食品行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。果糖具有優(yōu)越的代謝性能，其代謝過(guò)程不依賴(lài)胰島素[4]，不會(huì)引起血糖、胰島素、胰高血糖素的較大變化[5]，因此常被作為糖尿病人的甜味食品[6]。果糖代謝不會(huì)產(chǎn)生乳酸，能對(duì)體內(nèi)消耗蛋白質(zhì)有抑制作用，能夠迅速提高并且補(bǔ)充人體所需的能量，使得人體耐力以及代謝得到強(qiáng)化，因此常被制作為功能性飲料，為運(yùn)動(dòng)員及體力勞動(dòng)者快速恢復(fù)體力[7]；果糖因其爽口，風(fēng)味好、溫和無(wú)異味、透明度好被大量用于軟飲料產(chǎn)品，如可樂(lè)型飲料、汽水、果汁飲料、果露等。果糖入口后不殘留，有水果的優(yōu)質(zhì)甜味，也能增強(qiáng)果香，在發(fā)酵型烘焙食品中果糖的發(fā)酵性、焦化性及保濕性可以作為優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮出來(lái)。并在產(chǎn)品的銷(xiāo)售過(guò)程中有效地防止產(chǎn)品發(fā)干、變硬，發(fā)霉等[8]。關(guān)鍵酶右旋糖酐蔗糖酶的研究也越來(lái)越受到研究人員的重視。Tsuchiya等[9]報(bào)道右旋糖酐蔗糖酶搖瓶培養(yǎng)較靜止培養(yǎng)時(shí)酶活力高。Alsop[10]報(bào)道在空氣攪動(dòng)的情況下右旋糖酐蔗糖酶的酶活力也高于無(wú)氧或純氧的條件。Veljkovic等[11]研究證明當(dāng)生物反應(yīng)器中氣體流量與菌體最大耗氧量一致時(shí)酶活力最高。Lazic等[12]發(fā)現(xiàn)L. mesenteroids ZDRAVLJE SR-P在pH5.5，攪拌速率200 r/min；進(jìn)氣流速0.05 vvm時(shí)，酶活力最高34 DSU/mL。變旋糖酐蔗糖酶受3-脫氧-3-氟-α-D-呋喃葡萄糖、2-氨基乙醇的抑制[13]。

基因工程技術(shù)的發(fā)展使右旋糖酐蔗糖酶工程菌的構(gòu)建和表達(dá)研究的發(fā)展加快。Wilke-Douglase等[14]首次從L. mesenteroids NRRL B2512F克隆得到右旋糖酐蔗糖酶基因darS，通過(guò)巨大芽孢桿菌表達(dá)所獲得的右旋糖酐蔗糖酶酶活力為0.065 U/mL，經(jīng)過(guò)高密度培養(yǎng)后酶活力高達(dá)28.6 U/mL[15]。2006年國(guó)外有報(bào)道通過(guò)克隆darS在大腸桿菌中表達(dá)，采用0.2mmol/L 異丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）作為誘導(dǎo)劑，獲得的右旋糖酐蔗糖酶活力達(dá)到5.85 U/mL[16]。不過(guò)IPTG價(jià)格昂貴，使用量過(guò)多時(shí)有毒性，并且提高了工業(yè)生產(chǎn)成本。因此研發(fā)1種降低IPTG使用量的誘導(dǎo)方法具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)成功構(gòu)建右旋糖酐蔗糖酶工程菌株E. coli BL21（DE3）/pET28-dexYG,并分別利用IPTG和乳糖作為誘導(dǎo)劑對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并利用兩種誘導(dǎo)劑進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)研究，在降低成本的同時(shí)獲得較好的表達(dá)效果，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

基因工程菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET28-dexYG由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

卡納霉素 上海捷瑞生物工程有限公司；IPTG德國(guó)默克公司；其他常用試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化鈉10，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、硝酸鉀10 g/L、MgSO4（1mol/L）100μL/L、甘油（500g/L）10mL/L、M9鹽90 mL/L，p H 7.0。其中M 9鹽配方：磷酸氫二鈉17.105 g/200 mL、磷酸二氫鉀3g/100mL、氯化銨1g/100mL。

1.3 儀器與設(shè)備

SL202N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；WH-861旋渦混合器 太倉(cāng)市科教儀器廠；W-1調(diào)節(jié)萬(wàn)用電爐 通州市滬通實(shí)驗(yàn)儀器廠；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-3CT酸度計(jì)上海大中分析儀器廠；CHA-SA氣浴恒溫?fù)u床 江蘇金壇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；LS-B50L立式圓形壓力蒸汽滅菌器 張家港市化菱醫(yī)療設(shè)備有限公司；KS-150超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波科生儀器廠；VIS-723紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；MDF-U332醫(yī)用低溫冰箱（－50℃） 日本三洋公司；HH-2恒溫水浴鍋江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；微量移液器 上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 右旋糖酐蔗糖酶的表達(dá)培養(yǎng)

將基因工程菌BL21（DE3）/pET28-dexYG于37℃、含50mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜富集培養(yǎng)[17-18]。將過(guò)夜富集培養(yǎng)后的菌液按照1%的接種量接種到100 mL含卡那霉素50 μg/mL的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，37℃、250 r/min培養(yǎng)直到菌濃（OD600nm）達(dá)到1.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，25℃、250 r/min誘導(dǎo)4 h來(lái)使得右旋糖酐酶表達(dá)，離心取菌體。

1.4.2 右旋糖酐蔗糖酶的酶活力測(cè)定

方法參照文獻(xiàn)[19]。酶活力單位（U）定義：在25℃條件下，1 mL底物反應(yīng)液中1h催化蔗糖產(chǎn)生0.1 mg果糖所需要的酶量。

1.4.3 IPTG和乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)

將實(shí)驗(yàn)分成A、B、C、D組，4組均為發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，A、B兩組為IPTG與乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)，C組IPTG單獨(dú)誘導(dǎo)D組乳糖單獨(dú)誘導(dǎo)A和C組到OD600nm=2.0時(shí)開(kāi)始進(jìn)行誘導(dǎo)，B和D兩組到OD600nm=3.0開(kāi)始誘導(dǎo)。A、B兩組均為125 μL 0.1 mmol/L IPTG+2.5 g/L乳糖混合誘導(dǎo)，C組為250 μL 0.1 mmol/L的IPTG單獨(dú)誘導(dǎo)，D組為2.5 g/L乳糖單獨(dú)誘導(dǎo)；A、B兩組在誘導(dǎo)3、4、5、6、7 h時(shí)分別取樣15 mL測(cè)酶活力，C組誘導(dǎo)4 h后測(cè)定酶活力，D組誘導(dǎo)6 h后測(cè)酶活力。

1.4.4 IPTG和乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)條件優(yōu)化

1.4.4.1 乳糖添加量對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程的影響

將實(shí)驗(yàn)分成A、B、C、D、E、F共6組，分別按照發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行配制。A、C、E組在O D600nm=2.0時(shí)開(kāi)始進(jìn)行誘導(dǎo)，B、D、F組在OD600nm=3.0開(kāi)始誘導(dǎo)。其中A、B兩組加入60 μL 0.1 mmol/L IPTG+1.25 g/L乳糖混合誘導(dǎo)，C、D兩組加入60 μL 0.1 mmol/L IPTG+2.5 g/L乳糖混合誘導(dǎo)，E、F兩組加入60 μL 0.1 mmol/L IPTG+5.0 g/L乳糖混合誘導(dǎo)。A、C、E 3組在菌濃OD600nm=2.0時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，B、D、F 3組在菌濃OD600nm=3.0時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)。4組均在誘導(dǎo)3、4、5、6、7 h時(shí)分別取樣15 mL測(cè)定酶活力。

1.4.4.2 IPTG含量對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程同1.4.4.1節(jié)，將A、C組在OD600nm=2.0時(shí)開(kāi)始進(jìn)行誘導(dǎo)，B、D組在OD600nm=3.0開(kāi)始誘導(dǎo)，A、B兩組為加入78 μL 0.1 mmol/L IPTG+2.5 g/L乳糖混合誘導(dǎo)，C、D兩組為加入95 μL 0.1 mmol/L IPTG+2.5 g/L乳糖混合誘導(dǎo)4 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 IPTG和乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)

表1 IPTG和乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)所得右旋糖酐蔗糖酶酶活力Table 1 Activity of dextransucrase induced by the presence of both IPTG and lactose

由表1可知，比較C、D兩組實(shí)驗(yàn)可以看出，當(dāng)乳糖單獨(dú)作為誘導(dǎo)物的時(shí)候，所誘導(dǎo)產(chǎn)生的重組右旋糖酐蔗糖酶酶表達(dá)活力較低，乳糖不適合作為獨(dú)立誘導(dǎo)物來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)酶。比較A、B、C、D 4組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，IPTG與乳糖混合使用作為誘導(dǎo)物能產(chǎn)生較好的效果。比較A、B兩組看出，不同的菌濃對(duì)酶活力表達(dá)并沒(méi)有特別的影響，但是不能保證在IPTG用量繼續(xù)較少的情況下，菌濃對(duì)其依然沒(méi)有特別影響，所以在以后的實(shí)驗(yàn)中，菌濃需要繼續(xù)同時(shí)考察OD600nm=2.0以及OD600nm=3.0兩種情況。由于最終目的是節(jié)約成本，即降低IPTG用量，在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，繼續(xù)考察降低IPTG的用量，并同時(shí)考察乳糖用量增減對(duì)此過(guò)程的影響。

2.2 IPTG和乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.2.1 乳糖添加量對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程的影響

表2 IPTG和乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)所得右旋糖酐蔗糖酶酶活力Table 2 Activity of dextransucrase induced by the presence of both Table 2 Activity of dextransucrase induced by the presence of both IPTG and lactose ose

由表2可知，在降低IPTG濃度后，所誘導(dǎo)得到的酶活力很低。主要原因?yàn)楫?dāng)IPTG用量過(guò)低的時(shí)候，不能有效的抑制菌體的生長(zhǎng)，無(wú)法進(jìn)行持續(xù)的誘導(dǎo)而使得合成的可溶性蛋白減少；當(dāng)提高加入乳糖的量時(shí)，酶活力相對(duì)并沒(méi)有提高；分別比較上述6組可以看出，當(dāng)IPTG過(guò)低時(shí)，菌濃對(duì)酶活力沒(méi)有特別的影響；分別比較A、C、E 3組與B、D、F 3組可以看出，乳糖質(zhì)量濃度提高并不能使得酶活力提高，反而會(huì)抑制酶活力，所以在二者混合誘導(dǎo)時(shí)，乳糖的量不能過(guò)多，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示選擇乳糖質(zhì)量濃度為2.5 g/L；將0.1 mmol/L IPTG用量定在60～125 μL，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)情況選擇78 μL以及95 μL 2個(gè)值來(lái)考察。

2.2.2 IPTG用量對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程的影響

圖1 IPTG用量對(duì)右旋糖酐蔗糖酶酶活力的影響Fig.1 Effect of IPTG concentration on dextransucrase activity

由圖1可知，比較A、B兩組數(shù)據(jù)，當(dāng)添加78 μL 0.1 mmol/L IPTG時(shí)，所得的酶活力相對(duì)較低，最適合條件為OD600nm=3.0條件下誘導(dǎo)5 h，所得的酶活力為31.10 U/mL，酶活力不是很理想；比較C、D兩組數(shù)據(jù)，當(dāng)添加95 μL 0.1 mmol/L IPTG時(shí)，所得的酶活力最高為在OD600nm=3.0時(shí)IPTG和乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)4 h后右旋糖酐蔗糖酶酶活力達(dá)到40.44 U/mL，相對(duì)較高。得出最優(yōu)組合為95 μL 0.1 mmol/L IPTG+2.5 g/L乳糖。

3 結(jié) 論

當(dāng)乳糖單獨(dú)使用被用來(lái)作為誘導(dǎo)物的時(shí)候，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的右旋糖酐蔗糖酶活力很低，不能用來(lái)作為誘導(dǎo)劑；而使用IPTG作為誘導(dǎo)物的時(shí)候，能夠得到比較理想的效果。但是IPTG是有毒物質(zhì)，所以在不得不使用IPTG作為誘導(dǎo)物的情況下，需要盡量減少I(mǎi)PTG的用量。在OD600nm=3.0、0.1 mmol/L IPTG 95 μL+ 2.5 g/L乳糖情況下，混合誘導(dǎo)4 h，酶活力可以達(dá)到40.44 U/mL。與單獨(dú)IPTG誘導(dǎo)相比，IPTG用量減少了62%，而酶活力僅減少了8%。同文獻(xiàn)[19-20]比較，IPTG用量減少了5%，而酶活力保持在相當(dāng)?shù)乃健＝Y(jié)果表明IPTG與乳糖混合誘導(dǎo)可行，既可以降低生產(chǎn)的成本，又可以減少I(mǎi)PTG作為有毒物質(zhì)所帶來(lái)的不利影響，為工業(yè)應(yīng)用提供參考。

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Combinatorial Induction of Recombinant Dextransucrase Expression in E. coli by IPTG and Lactose

LI Pan-feng, ZHANG Hong-bin*, HU Xue-qin
(Department of Pharmaceutical Engineering, School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In order to explore the combinatorial induction of recombinant dextransurase experssion in E. coli by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) and lactose, a mixture of IPTG and lactose was added to the cell culture to induce the expression of recombinant dextransurase. Based on the optimal culture medium, IPTG concentration and the amount of lactose added, bacteria concentration and induction time revealed significant impacts on the enzyme activity. The results showed that the optimal concentrations of IPTG and lactose were 0.1 mmol/L and 2.5 g/L, respectively, and optimal induction time was 4 h at 25 ℃. Under these culture conditions, the activity of dextransucrase could reach up to 40.44 U/mL. The combinatorial induction of recombinant E. coli dextransurase by IPTG and lactose was feasible, greatly reducing the dosage of IPTG and industrial production costs.

isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG); lactose; dextransucrase; expression; combinatorial induction

Q814

A

1002-6630(2014)01-0185-04

10.7506/spkx1002-6630-201401036

2013-04-06

安徽省長(zhǎng)三角科技攻關(guān)基金項(xiàng)目（10140702001)；安徽省自主創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)（2013AKKG0391)

李攀峰（1988—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊概c制藥工程。E-mail：395427915@qq.com

*通信作者：張洪斌（1970—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槊概c制藥工程。E-mail：zhb5678@163.com