創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠杏仁核神經(jīng)元Akt和mTOR磷酸化降低*

耿 菲，劉 昊，王海濤△，徐愛(ài)軍，盧鶴翔，闞 泉

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，河北唐山 063000;2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)欄目編輯:陳志宏)

隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外不斷增多，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)的發(fā)生率越來(lái)越高，成為目前研究的熱點(diǎn)之一[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，PTSD大鼠海馬、杏仁核部位存在明顯的神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象[2-3]。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存和增殖[4-5]。但該通路在PTSD杏仁核神經(jīng)元中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。在大鼠接受SPS后立即給予不可逃避的足底電擊(single inescapable electric foot shock after SPS procedures, SPS & S)，是 研 究PTSD較好的動(dòng)物模型[6]。本研究利用SPS & S誘導(dǎo)的大鼠PTSD動(dòng)物模型，觀察了PTSD大鼠杏仁核PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的變化情況，以探討PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在PTSD發(fā)病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 健康成年雄性Wistar大鼠40只，體重(180±10)g，由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK京2009-0004)。兔抗鼠p-Akt多克隆抗體、羊抗鼠p-mTOR多克隆抗體，購(gòu)自Santz Cruz公司;免疫印跡相關(guān)試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物分組、PTSD模型的建立及取材 隨機(jī)將大鼠分為對(duì)照組和模型組，每組20只。模型組采用SPS & S應(yīng)激制備PTSD大鼠模型，造模后22-25℃、晝夜節(jié)律、自由飲水、攝食飼養(yǎng)7d。對(duì)照組不做處理。兩組大鼠分別于靜養(yǎng)結(jié)束后處死，行免疫組化染色和Western blot分析。

1.3 免疫組化染色 每組隨機(jī)選取10只大鼠，2%戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛心臟灌流固定，取腦組織常規(guī)石蠟包埋，5 μ m切片。行SABC免疫組織化學(xué)染色，一抗工作液濃度1:200，4℃冰箱過(guò)夜，二抗室溫孵育1小時(shí)，DAB顯色。用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行半定量分析，測(cè)定平均光密度(OD)值。

1.4 Western blot檢測(cè) 取兩組剩余的10只大鼠，2%戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射，斷頭取腦。根據(jù)圖譜，在體視顯微鏡下快速分離杏仁核，提取總蛋白。定量后蛋白上樣量30μ g，行120g/L SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，一抗(p-Akt，1:500;p-mTOR，1:350)4℃孵育過(guò)夜，二抗IgG(1:5000)室溫孵育1h，ECL顯色。同樣方法進(jìn)行內(nèi)參照β-actin的Western blot分析。以目的條帶與內(nèi)參照的光密度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 p-Akt和p-mTOR免疫陽(yáng)性產(chǎn)物均為棕黃色顆粒，定位于神經(jīng)元胞漿。對(duì)照組p-Akt、p-mTOR免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞較多、模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，定量分析結(jié)果顯示，模型組p-Akt、p-mTOR的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)附表:

附表 杏仁核神經(jīng)元p-Akt和p-mTOR的表達(dá)(±s，n=10)

附表 杏仁核神經(jīng)元p-Akt和p-mTOR的表達(dá)(±s，n=10)

組別 p-Akt p-mTOR免疫組化染色 免疫印跡分析 免疫組化染色 免疫印跡分析對(duì)照組 0.514±0.042 0.563±0.054 0.481±0.032 0.671±0.051模型組 0.154±0.026 0.261±0.016 0.162±0.006 0.242±0.014 P ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 Western blot結(jié)果 模型組杏仁核p-Akt、p-mTOR的相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，附圖、附表)。表明模型組大鼠杏仁核Akt和mTOR蛋白磷酸化水平降低。

附圖 杏仁核p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)(Western blot法)

3 討論

目前，PTSD發(fā)病率增高給社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，探討其發(fā)病機(jī)制成為當(dāng)今的熱點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。臨床資料和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均表明，PTSD時(shí)杏仁核體積縮小、神經(jīng)元凋亡明顯增加[7-9]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上[9-12]，探討了PTSD時(shí)杏仁核神經(jīng)元Akt/mTOR信號(hào)通路的變化。

Akt和mTOR是Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，該通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。Akt又稱(chēng)蛋白激酶B(PKB)，是PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的效應(yīng)因子，其磷酸化可導(dǎo)致下游磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括激活其下游的mTOR以及與靶蛋白之間的相互作用，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活、增殖與凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，PTSD模型大鼠杏仁核p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)明顯降低。提示，在PTSD發(fā)病過(guò)程中杏仁核神經(jīng)元Akt和mTOR的磷酸化程度較正常情況降低，因此減弱了對(duì)凋亡的調(diào)控作用，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加。在Akt/mTOR信號(hào)通路中，激活后的p-mTOR有兩條不同的下游通路，核糖體S6蛋白激酶(S6 kinase，S6K)和真核生物始動(dòng)因子4E結(jié)合蛋白l(4E binding protein 1,4E-BPl)。在PTSD時(shí)杏仁核神經(jīng)元信號(hào)調(diào)控中，p-mTOR具體通過(guò)哪條途徑控制細(xì)胞的生存和凋亡，值得進(jìn)一步深入研究。

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