煙草角斑病菌拮抗細菌篩選及抗菌活性物質研究

文景芝，趙黎明，楊曉敏，孫劍萍，劉振平

（1.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030；2.牡丹江煙草科學研究所，黑龍江牡丹江 157011；3.黑龍江省職工電化教育中心，哈爾濱 150001）

煙草角斑病菌拮抗細菌篩選及抗菌活性物質研究

文景芝1，趙黎明1，楊曉敏1，孫劍萍2，劉振平3

（1.東北農業(yè)大學農學院，哈爾濱 150030；2.牡丹江煙草科學研究所，黑龍江牡丹江 157011；3.黑龍江省職工電化教育中心，哈爾濱 150001）

研究從黑龍江省健康煙草植株及其根際土壤和海南三亞采集的20種雜草中分別分離到287和98個細菌分離物，篩選出對煙草角斑病菌有拮抗活性的菌株22個，其中來自三亞稗草葉片中的一株細菌PA-2的抑菌效果最好，抑菌效果穩(wěn)定。經形態(tài)學、生理生化及分子生物學鑒定，PA-2為銅綠假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）。篩選出最佳實驗室發(fā)酵配方：氮源1%（牛肉膏∶蛋白胨=5∶3），葡萄糖0.3%，NaCl 0.5%，KNO30.3%；最佳培養(yǎng)條件：發(fā)酵溫度28℃，培養(yǎng)基pH 7.0～7.5，接種量4%，裝液量為250 mL三角瓶中裝液50 mL。PA-2優(yōu)化發(fā)酵液的田間防效達69.77%，比農用鏈霉素防效提高24.47%。采用硫酸銨分級沉淀法分離抑菌活性物質，結果表明，在(NH4)2SO4濃度為30%～90%各濃度梯度下均有抑菌活性物質沉淀，其中60%～70%（不含60%）是抑菌活性物質的最適鹽析飽和度。抑菌活性物質具有較強的熱穩(wěn)定性、較好的蛋白酶耐受性、較好的耐堿性、較差的耐酸性，能溶于部分有機溶劑，經乙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和丙酮萃取后，該抑菌活性物質抑菌活性下降范圍為1.4%～4%。確定該抑菌活性物質為小分子堿性、水溶性脂肽類物質。

煙草角斑??；拮抗細菌；16S rDNA鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化；抑菌活性物質

由Pseudomonas syingae pv.tabaci(Wolf et Foster)引起的煙草角斑病是一種暴發(fā)性、毀滅性細菌病害，影響煙草質量和產量。目前國內煙草品種對抗角斑病均無高抗性[1]。農用鏈霉素是生產上防治煙草角斑病的常用藥劑[2]，由于連續(xù)使用，病原菌已產生抗藥性[3]。煙草角斑病防治采取以調控煙田生態(tài)環(huán)境，利用生物防治，重病田進行藥劑防治綜合防治策略。研究者利用有益微生物及其代謝產物來防治煙草角斑病。張曉雯等和喬嬋等分別篩選出對煙草角斑病菌具有較好防效的鏈霉菌株H210和熒光假單胞桿菌PF7-5，但研究僅限于抑菌效果和田間防效測定[4-5]，缺乏抑菌活性物質研究。關于拮抗細菌產生的活性物質研究較多，煙草角斑病菌拮抗菌產生的抑菌活性物質研究較少。研究發(fā)現，拮抗細菌產生的活性物質種類具有多樣性?？股鼐哂泻軓娹卓箤；?，可抑制同種內不同株系或近緣種細胞生長[6]。另一抑菌活性物質為蛋白類，主要包括細胞壁降解酶類和其他類抗菌蛋白[7]。嗜鐵素（Siderophore）類物質是大量根際細菌和植物內生細菌分泌的拮抗代謝物質代表，拮抗細菌通過自身的作用形成一種病原微生物不能利用的Fe3+-嗜鐵素復合物[8]，在低鐵環(huán)境下，拮抗菌可通過自身特異功能吸收Fe3+，使病原菌受到抑制，達到防治病害目的[9]，這些物質對植物抵抗病菌侵入、潛伏、擴展、蔓延有重要作用。本研究從不同品種的煙草植株、煙草根際土壤和野生雜草中分離出大量細菌菌株，篩選出一株對煙草角斑病菌具有較好拮抗效果的細菌，對其進行形態(tài)學、生理學鑒定和16S rDNA鑒定，并進行發(fā)酵條件優(yōu)化，測定發(fā)酵液田間防效。通過硫酸銨分級沉淀法分離出抑菌活性物質，為以拮抗活性物質為主要成分微生物殺菌劑的研制和應用提供理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試煙草品種、病菌及培養(yǎng)基國內主栽中感煙草角斑病的煙草品種K326和煙草角斑病菌Pseudomonas syringae pv.tabaci均由牡丹江煙草科學研究所提供。其中K326用于田間防效試驗。

KMB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)液和PDA培養(yǎng)基分別用于煙草角斑病菌的培養(yǎng)、細菌的分離、發(fā)酵和保存。培養(yǎng)基配方參照文獻[10]。

1.2 植物體內及煙草根際土壤中細菌的分離

采用常規(guī)稀釋平板法分離煙草和雜草器官內外和煙草根際土壤中的細菌[11]，挑取不同類型菌落，在NA平板上反復劃線純化培養(yǎng)，挑取單個菌落移至PDA斜面上保存。

1.3 煙草角斑病菌拮抗細菌的篩選

參照文獻[12]方法。

1.4 煙草角斑病菌拮抗細菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定

利用逐級稀釋法，將拮抗細菌用無菌水稀釋至10-7，將10-3至10-7菌懸液分別涂于NA平板上，28℃培養(yǎng)2～3 d，出現單菌落后，觀察菌落的形狀、大小、顏色、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、是否產生色素等。挑取菌體進行革蘭氏染色[13]。選擇老齡菌配制菌懸液，進行芽孢染色，觀察芽孢的形狀、大小及著生位置[13-14]。用透射電子顯微鏡觀察拮抗細菌鞭毛的著生位置、數目及菌體形狀，并測量菌體大小。

1.4.2 生理生化特性測定

拮抗菌株的生理生化特性測定參照文獻[15]，菌懸液濃度3×108cfu·mL-1[16]。

1.4.3 16S rDNA鑒定

采用Schroth等方法提取拮抗細菌總DNA[17]。以總DNA為模板，采用細菌通用引物27F和1492R（上海生工合成）進行PCR，擴增片段長度1400bp。PCR反應體系及其測定參照文景芝等方法[12]。將PCR產物測序，并與GenBank數據庫序列進行BLAST分析比對，確定拮抗細菌的分類地位。

1.5 拮抗細菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.5.1 單因子試驗

參照文景芝等方法[12]進行單因子試驗，確定拮抗菌生長的最適碳源、有機氮源、無機氮源及其最適濃度。

1.5.2 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

依據單因素試驗結果，選取較優(yōu)碳源、較優(yōu)有機氮源、較優(yōu)無機氮源、NaCl的3種濃度組合進行4因素3水平正交試驗，測定各條件下OD625值及其對煙草角斑病菌的抑菌活性（見表1）。

表1 L9(34)正交水平因素Table 1 L9(34)factors and levels of the orthogonal test(%)

1.5.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用優(yōu)化后的NB發(fā)酵培養(yǎng)液，參見文獻[12]方法進行處理，測定培養(yǎng)后菌液的OD625值及其對煙草角斑病菌的抑菌活性，分別確定最適合拮抗菌生長的溫度、pH、接種量及最適合的通氣量。

1.6 拮抗細菌對煙草角斑病的田間藥效試驗

試驗于2011年6～7月在牡丹江煙草科學研究所試驗場煙田進行。每小區(qū)煙株15株，株距0.9 m×0.5 m。共設5個處理：A-拮抗菌發(fā)酵液（用普通NB培養(yǎng)液培養(yǎng)，稀釋6倍）；B-拮抗菌優(yōu)化發(fā)酵液（用優(yōu)化后的培養(yǎng)液培養(yǎng)，稀釋6倍）；C-NB培養(yǎng)液空白對照；D-優(yōu)化后的培養(yǎng)液空白對照；E-20%農用鏈霉素可濕性粉劑（瑞田生化有限公司）。各處理采用隨機區(qū)組排列，重復3次。各處理在團棵期采用高壓噴霧法進行第1次噴霧，A、B、C、D、E分別噴施各處理液，每處理噴霧2 L，噴霧后保濕。2 d后各處理均噴施病原菌2 L（6倍稀釋液，濃度約6.0×108cfu·mL-1）后保濕。噴施病原菌后每隔5 d進行1次病害調查，同時進行下次噴施各處理液（同第1次），共調查3次。每小區(qū)調查10株煙株，每株調查中下部葉片10片，以每片葉病斑面積占整個葉片面積的百分比分級，記錄總葉片數、各級病葉數，計算病情指數及防治效果。

病害分級標準參照中華人民共和國煙草病害分級標準（YC T39-1996），防效計算參見文獻[12]方法。

1.7 拮抗細菌抑菌活性物質的提取及初步鑒定

1.7.1 活性物質的提取

參照劉永峰的硫酸銨分級沉淀法[18]。

1.7.2 活性物質的抑菌活性檢測

取5 mL病原菌發(fā)酵液混入NA培養(yǎng)基中制成含病原菌的平板。在平板中央打1個7 mm的孔，取0.1 mL上述分級提取的粗提物注入孔內，以拮抗菌發(fā)酵液為對照，每處理3次重復，28℃培養(yǎng)2～3 d，測量抑菌圈直徑，分析比較不同梯度沉淀物質的抑菌活性差異。

1.7.3 活性物質的生理生化特性測定

參照張成省等方法對活性物質進行處理[19]，然后參照前文方法測定抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 煙草角斑病菌拮抗細菌的篩選

從黑龍江省煙草植株及其根際土壤和海南三亞的雜草中分別分離到287和98個細菌分離物，只有來自煙草植株及根際土壤中的21株和來自三亞稗草葉片中的1株（命名為PA-2）細菌對煙草角斑病菌具有拮抗作用，抑菌帶寬度范圍5.3～15.3 mm，其中以PA-2的抑菌效果最好，抑菌效果穩(wěn)定（見表2）。

表2 煙草角斑病菌拮抗細菌的篩選Table 2 Screening of the antagonistic bacteria to Pseudomonas syringae pv.tabaci

2.2 煙草角斑病菌拮抗細菌PA-2的鑒定

2.2.1 形態(tài)學及生理生化鑒定

PA-2在NA培養(yǎng)基上生長良好，單菌落形態(tài)為圓形或近圓形，扁平狀且周圍不規(guī)則，中等大小，表面光滑，半透明，產生藍綠色色素（見圖1A），菌落表面呈黏稠狀。革蘭氏染色陰性(見圖1B）。菌體桿狀，不產生芽孢。透射電子顯微鏡下菌體呈桿狀，一端有單鞭毛，菌體較小且長短不一，約為（0.5～1）μm×（1～1.5）μm，分散、成對或短鏈狀排列（見圖2），具有運動性及好氧特性。

圖1 菌落特征及革蘭氏染色Fig.1 Morphology of the colony and gram stain of PA-2

圖2 拮抗細菌PA-2的電鏡觀察（30000×）Fig.2 PA-2 under electron microscope

2.2.2 生理生化特性

熒光反應、蔗糖氧化發(fā)酵、吲哚產生、從蔗糖產生還原物質、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇試驗、淀粉水解試驗均為陰性。葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、接觸酶反應、明膠液化試驗、脂酶（Tween 80）試驗、硝酸鹽還原試驗、膿青素的產生試驗、檸檬酸鹽利用試驗均為陽性。NaCl含量2%、5%、7%、10%時生長良好，且41℃條件下生長狀態(tài)較好。

根據PA-2的形態(tài)特征及生理生化特性，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[20]及《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]，初步鑒定菌株PA-2為銅綠假單孢桿菌（Pseudomonas aeruginosa）。

2.2.3 16S rDNA鑒定

從PA-2基因組DNA中成功擴增出與預期大小一致的特異性片段，大小為1 438 bp（見圖3）。登錄GenBank數據庫，將測序結果與GenBank中已報道序列進行同源性比較，結果表明，PA-2與HM224410.1（Pseudomonas aeruginosa strain JL091016）、FJ907192.1（Pseudomonas aeruginosa isolate 9）、FJ972533.1（Pseudomonas aeruginosa isolate 10）和FJ907193.1（Pseudomonas aeruginosa isolate 10）的同源性均達99%，證明該菌株為Pseudomonas aerugi?nosa。

圖3 PA-2 16S rDNA的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis for PCR product of 16S rDNA of PA-2

2.3 拮抗細菌PA-2發(fā)酵條件的優(yōu)化

碳源試驗結果表明，葡萄糖為最適碳源（見圖4），0.1%濃度最佳（見圖5）。有機氮源試驗結果表明，牛肉膏、蛋白胨為氮源時抑菌效果較好（見圖6），在牛肉膏與蛋白胨組合濃度為1%（見圖7）時PA-2的生長量最大且二者的比例為5:3抑菌效果最好（見圖8）。以KNO3為無機氮源時PA-2產量最高（見圖9），且抑菌活性顯著高于其他無機氮源；一定量的KNO3和NaCl均能促進PA-2生長，亦能提高PA-2抑菌活性，其中以0.3%NaCl（見圖10）和0.5%KNO3（見圖11）效果最好。

圖4 單一碳源對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.4 Effect of single carbonhydrate on population and antibacterial activity of PA-2

圖5 葡萄糖濃度對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on population and antibacterial activity of PA-2

圖6 單一有機氮源對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.6 Effect of single organic nitrogen on population and antibacterial activity of PA-2

圖7 牛肉膏與蛋白胨組合對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.7 Effect of beef extract combined with peptone on population and antibacterial activity of PA-2

圖8 牛肉膏與蛋白胨組合濃度對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.8 Effect of the concentration of beef extract combined with peptone on population and antibacterial activity of PA-2

圖9 單一無機氮源對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.9 Effect of single inorganic nitrogen on population and antibacterial activity of PA-2

圖10 NaCl對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.10 Effect of sodium chloride on population and antibacterial activity of PA-2

圖11 KNO3濃度對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.11 Effect of potassium nitrate concentration on population and antibacterial activity of PA-2

PA-2最佳實驗室發(fā)酵配方為氮源1%，其中牛肉膏∶蛋白胨=5:3；KNO30.5%；葡萄糖0.1%；Na?Cl 0.3%。按此條件的試驗結果在氮源、葡萄糖、NaCl和KNO34因素3種不同濃度正交試驗表9次試驗中并未出現，通過做補充試驗，結果得到16.9 mm的抑菌帶寬度，大于正交試驗結果中的最高值16.1 mm，說明利用正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基的試驗成功。

發(fā)酵條件篩選試驗結果表明，PA-2最適生長溫度為28℃（見圖12），最適pH為7.0～7.5（見圖13），接種量在4%（見圖14），裝液量為50 mL時PA-2產量最大，發(fā)酵液抑菌活性也最高（見圖14）。

2.4 PA-2對煙草角斑病的田間藥效

PA-2防治煙草角斑病田間藥效試驗結果見表2。噴施3次生防菌后，PA-2優(yōu)化發(fā)酵液的防效達到69.77%，顯著高于其他處理。PA-2發(fā)酵液的防效達58.03%，顯著高于農用鏈霉素的防效。證明PA-2對煙草角斑病具有良好的田間防效，有進一步研發(fā)價值。

圖12 溫度對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.12 Effect of cultural temperature on population and antibacterial activity of PA-2

圖13 pH對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.13 Effect of pH on population and antibacterial activity of PA-2

圖14 接種量對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.14 Effect of inoculation volumes on population and antibacterial activity of PA-2

圖15 裝液量對PA-2產量和抑菌活性的影響Fig.15 Effect of medium volumes on population and antibacterial activity of PA-2

2.5 PA-2抑菌活性物質的提取及初步鑒定

PA-2無菌發(fā)酵液用硫酸銨分級沉淀提取后，測定提取物對煙草角斑病菌的抑菌活性，結果表明（見表3），硫酸銨30%～90%各飽和度沉淀物質均有抑菌活性，抑菌圈直徑為15.3～41.6 mm，其中60%～70%（不含60%）飽和度沉淀物拮抗效果最好，顯著優(yōu)于其他處理，說明在此飽和度下沉淀出的抑菌活性物質最多（見表4）。

表3 PA-2發(fā)酵液對煙草角斑病的田間藥效Table 3 Field effect of PA-2 fermentation liquid against tobacco angular leaf spot

表4 PA-2抑菌活性物質對煙草角斑病菌的抑菌效果Table 4 Antagonistic effect of the antagonistic active substances against P.syringae pv.tabaci

將上述抑菌活性物質分別經50、60、70、80和90℃處理30 min后，抑菌活性與對照處理（25℃）相比并未下降；100℃處理30 min和121℃高溫高壓（0.4 MPa）處理20 min后，抑菌活性下降25%。說明該抑菌活性物質對高溫具有耐受性（見圖16）。

上述抑菌活性物質經胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌活性比對照分別下降8.3%和12.5%，表明拮抗細菌PA-2產生的抑菌活性物質可能包括蛋白質類，但起抑菌活性的主要為非蛋白類。

經乙醇、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和丙酮萃取后，萃取物均顯示出一定抑菌活性，抑菌活性下降范圍在1.4%～4.0%，且隨著有機溶劑極性的增加，抑菌活性也逐漸增強。丙酮萃取物的抑菌活性最強，乙醇與丙酮萃取物的抑菌活性相當。根據“相似相容”原理，該活性成分的極性應該介于丙酮和乙醇之間。由于丙酮具有低毒性，且易燃，因此確定乙醇為最佳有機萃取溶劑。

圖16 抑菌活性物質經不同熱處理后的抑菌活性Fig.16 Antagonistic activity of the antagonistic active substances treated at different temperatures

在酸性和堿性條件下，抑菌活性物質的抑菌活性均表現出不同程度下降，且酸性條件下抑菌活性喪失程度相對較大，pH接近1.0時抑菌活性幾乎全部喪失。當pH達11.0時，抑菌活性下降24%，與對照差異不顯著。說明抑菌活性成分有較好的耐堿性，但耐酸性較差。

綜上所述，表明拮抗細菌PA-2產生的抑菌活性物質為一種小分子堿性、水溶性脂肽類。

3 討論與結論

細菌具有防治植物病害能力，目前主要有假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）、芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）等[15,20]。喬禪等從煙草根際土壤中篩選出一株熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，其對煙草角斑病的田間防效為87.34%[5]。防效表面較高，但是在對照區(qū)病情指數只有3.74和以清水為對照的情況下得出。如果以農用鏈霉素為參照，本研究生防菌株PA-2對煙草角斑病相對防效為54.01%，而喬禪等

研究表明，拮抗細菌產生抗菌活性物質包括低分子質量抗生素、細菌素、細胞壁降解酶和未鑒定的抗菌蛋白等。這些抑菌物質存在于植物體內，可伴隨拮抗菌在植物體內運轉，提高防病效果[21]。國內外研究多從天然產物中尋找生物活性物質，經分離、提純、測定分子結構，作為人工合成新農藥品種模板[22-23]。其共同特點是高效防治且不產生抗性，在環(huán)境中易被降解，是環(huán)境友好型農藥，利用微生物殺菌劑防治煙草角斑病前景廣闊。本研究結果表明，PA-2產生的抑菌活性物質耐高溫，對胰蛋白酶和蛋白酶K均不敏感，有較好耐堿性，確定該活性物質為一種小分子脂肽類，但起作用的活性物質以何種形式存在，尚需后續(xù)試驗進一步證明。

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ScreeningofantagonisticbacterialstrainagainstPseudomonas syringaepv.tabaciand studies on antagonistic active substances/

WENJingzhi1,ZHAO Liming1,YANG Xiaomin1,SUN Jianping2,LIU Zhenping3(1.School of Agriculture, Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Tobacco Research Institute of Mudanjiang, Mudanjiang Heilongjiang 157011,China;3.Workers Educational Technology Center of Heilongjiang Province,Harbin 150001,China)

In the present study,287 and 98 bacterial strains were isolated from healthy tobacco plants and their rhizospheric soil samples as well as 20 kinds of weeds from Hainan Province,in which 22 strains had antibacterial activity againstPseudomonas syingaepv.tabaci.The strain PA-2 that was identified as Pseudomonas aeruginosaby morphological,physiological and biochemical as well as molecular biology tests was isolated from the leaf ofEchinochloa crusgalliin Sanya and had the best inhibiting and stableeffect.The optimal fermentation medium components for PA-2 constituted of 1%of nitrogen(beef extract: peptone=5:3),0.1%of glucose,0.5%of sodium chloride,and 0.3%of potassium nitrate.The optimal fermentation conditions:cultural temperature 28℃,optimum initial pH 7.0-7.5,inoculation seed liquid 4% and 50 mL of loading liquid in a 250 flask.The field effect of PA-2 fermentation liquid against tobacco angular leaf spot was 69.77%,24.47%increase over the streptomycin.We used the ammonium sulfate precipitation classification method to separate the antibacterial active substances,the results showed that each 30%-90%saturation of(NH4)2SO4had precipitated antibacterial active substances,in which 60%-70% (exclusive 60%)was the most appropriate saturation.The antibacterial active substances had stronger heat stability,better tolerance to proteinase K,better resistance to alkali,but poor tolerance to acid,dissolved in parts of the organic solvents.The decreasing range of the antibacterial activity of extractants of Ethyl alcohol,Ethyl ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol and acetone was 1.4%-4.0%.So they might be a kind of alkaline and water-solubility antibacterial substance.

Pseudomonas syingaepv.tabaci;antagonistic bacterium;16S rDNA identification; optimization of fermentation condition;antagonistic active substance

S476+.9

A

1005-9369（2014）06-0016-08

時間 2014-6-11 16:10:16 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140613.0953.003.html

文景芝,趙黎明,楊曉敏,等.煙草角斑病菌拮抗細菌篩選及抗菌活性物質初步研究[J].東北農業(yè)大學學報,2014,45(6):16-23.

Wen Jingzhi,Zhao Liming,Yang Xiaomin,et al.Screening of antagonistic bacterial strain againstPseudomonas syringaepv. tabaciand studies on antagonistic active substances[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):16-23.(in Chinese with English abstract)

2013-12-04

黑龍江省科技計劃項目（HN200810，HN200811）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目（2007RFXXN005）

文景芝（1964-），女，教授，博士，博士生導師，研究方向為植物病害生物防治。E-mail:jzhwen2000@163.com