番茄果實光滑基因F的分子標(biāo)記篩選及種質(zhì)資源鑒定

許向陽，于亭亭，趙婷婷，李帥，姜景彬，張賀，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄果實光滑基因F的分子標(biāo)記篩選及種質(zhì)資源鑒定

許向陽，于亭亭，趙婷婷，李帥，姜景彬，張賀，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

以含F(xiàn)基因的果實光滑型品種12509為母本，以果實皺褶型品種12510為父本配制雜交組合，以親本、F1及其F2代分離群體為研究材料，采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)篩選與果實光滑基因F連鎖的分子標(biāo)記。通過對256對AFLP引物進行篩選，獲得6個與F基因連鎖的標(biāo)記：E13M08、E11M07-B、E11M12-D、E11M08-A、E01M10和E10M16-E，連鎖遺傳距離分別為6.4、8.5、10.9、17.1、23.5和24.2 cM。將E13M08標(biāo)記用于種質(zhì)資源篩選，獲得45份果實光滑型材料，為番茄外觀品質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)。

番茄；果實；F基因；AFLP；種質(zhì)資源

影響番茄果實形狀的主要位點有ovate、sun、fs8.1、f和lc[1]，此外也發(fā)現(xiàn)幾個次要位點存在。研究表明，番茄果實顏色受B、og、hp、dg（hp? dg）、Del、MOB等9個基因位點控制[2]，目前番茄育種工作主要著重于果實形狀、顏色、畸形果等外觀品質(zhì)研究，果實表面光澤度和光滑度與有無棱褶等方面有待進一步研究，以培育更高商品性。

目前有多種分子標(biāo)記技術(shù)，如以Southern雜交為基礎(chǔ)RFLP、VNTR，以PCR為基礎(chǔ)SSR、SCAR、RGA等[3]，基于限制性酶切和PCR的DNA標(biāo)記，AFLP、CAPS等[4]，基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標(biāo)記、SNP、RAPD，具有篩選準(zhǔn)確度高，可縮短育種周期等優(yōu)點。目前，關(guān)于番茄果實光滑基因F的分子標(biāo)記研究國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道，本文應(yīng)用果實光滑型品種12509為母本和果實皺褶型品種12510為父本雜交獲F1代，經(jīng)F1代自交構(gòu)建標(biāo)記F2代群體；利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對親本、F1代及F2代群體進行篩選，獲得與果實光滑基因F緊密連鎖的標(biāo)記，采用JoinMap4.0遺傳作圖軟件進行遺傳連鎖分析，將該AFLP標(biāo)記定位，確定連鎖遺傳距離，利用所獲得的連鎖標(biāo)記對種質(zhì)資源進行篩選，對需鑒定的種質(zhì)資源進行田間表型調(diào)查，比較二者吻合率，確定標(biāo)記準(zhǔn)確性，為果實光滑型番茄遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

紫外分光光度計、高壓滅菌鍋、小型高速離心機、低溫離心機、-20℃冰箱、-80℃冰箱、超凈工作臺、液氮罐、德國Biometra T-Gradient The?moblock型PCR儀、凝膠自動成像系統(tǒng)（GDS-800）、系列電泳儀、電泳槽等瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)設(shè)備（DYY-8B型），聚丙烯酰胺凝膠電泳的相關(guān)設(shè)備、通風(fēng)櫥、Eppendorf Research和Reference系列移液器、電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型）及其他常用分子生物學(xué)試驗設(shè)備。

1.1.2 試劑

EDTA-Na2H2O、CTAB、RNase、Mse I、Eco R I、2×Taq Master Mix酶、ATP、T4DNA連接酶均為MBI公司產(chǎn)品，AFLP引物及接頭、DNA Marker由北京六合華大基因科技股份有限公司合成或生產(chǎn)，Repel、Binding由北京鼎國生物技術(shù)公司生產(chǎn)，尿素、過硫酸銨、TEMED均為Amsensco。其他試劑如異戊醇、氯仿、氫氧化鈉、異丙醇、甲醛、冰乙酸等化學(xué)試劑由哈爾濱市寶瑞生物試劑公司和哈爾濱市德美試劑公司提供。瓊脂糖、Tris-HCl為進口分裝，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 材料

1.2.1 番茄材料

番茄母本材料12509為果實光滑型高代自交純合系，含有F基因；父本12510為果實皺褶型高代自交純合系，不含F(xiàn)基因；雜交F1代、自交F2代分離群體及70份用于種質(zhì)資源篩選的番茄材料，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組提供。

1.2.2 AFLP引物

試驗采用EcoR I和MseI酶切，其接頭序列為：

預(yù)擴增引物為Eco R I pre 和Mse I pre，序列為:

選擇性擴增的引物是根據(jù)番茄基因組大小和其堿基偏愛性，選擇上游E引物16條，下游M引物16條，其序列見表1。本試驗用256對AFLP引物進行分子標(biāo)記篩選，接頭采用E接頭和M接頭，所用AFLP引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 番茄果型鑒定

在番茄果實成熟期，經(jīng)田間表型觀察區(qū)分確定果實形狀，即光滑型果實與皺褶型果實，母本為光滑型果實，父本為皺褶型果實（果實表面有棱褶），F(xiàn)1代雜交群體均為光滑型果實，F(xiàn)2代群體中果型出現(xiàn)分離現(xiàn)象，如圖1所示。

1.3.2 番茄葉片DNA提取

在F2代分離群體果實成熟時期取其幼嫩葉片200 mg裝在已滅菌的EP管內(nèi)，液氮速凍后，-80℃貯存，試驗采用CTAB法[5]提取葉片DNA。1%瓊脂糖凝膠檢測提取物濃度，并用滅菌后去離子水將各樣本濃度稀釋至50 ng·μL-1，于-20℃冰箱內(nèi)貯存，以用于AFLP分子標(biāo)記研究。

1.3.3 番茄果型基因池建立

根據(jù)番茄果型的田間調(diào)查情況，分別從果實光滑及皺褶的植株中各隨機選取25株，利用BSA法[6]建立果型基因池。

表1 AFLP標(biāo)記的E引物和M引物Table 1 AFLP E primers and M primers

圖1 番茄成熟果實Fig.1 Tomatomature fruit

1.3.4 AFLP分子標(biāo)記

番茄葉片DNA采用EcoR I和MseI進行酶切。具體AFLP分子標(biāo)記方法[7]參考Vos等，酶切連接體系為：DNA（100～500 ng）3.0 μL，Eco RⅠadapter（5 pmol·μL-1）1.0 μL，MseⅠadapter（50 pmol·μL-1）1.0 μL，ATP（10 mmol·L-1）1.0 μL，10×Buffer 6.0 μL，EcoRⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，MseⅠ（10 U·μL-1）0.5 μL，T4DNA Ligase（5 U·μL-1）0.6 μL，加ddH2O至50 μL，反應(yīng)程序為37℃酶切與連接6～8 h（時間不宜過長）。

預(yù)擴增體系為DNA（酶切連接后產(chǎn)物）6.0 μL，EcoR I-primer 0.6 μL，MseI-primer 0.6 μL，2× TaqMaster Mix 8.0 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序為94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃ 1 min，24個循環(huán)；72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。取5 μL預(yù)擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中檢測擴增結(jié)果，依據(jù)條帶清晰度情況，確定將預(yù)擴產(chǎn)物稀釋40倍為最佳，以用于選擇性擴增，余下的預(yù)擴增產(chǎn)物于-20℃保存。

選擇性擴增體系為DNA（預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋40×）6.0 μL，Exx（50 ng·μL-1）1.0 μL，Mxx（50 ng·μL-1）1.0 μL，2×TaqMaster Mix 8.0 μL，加ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序為94℃3 min；94℃30 s，65℃30 s，（每個循環(huán)降低0.7℃），72℃1 min，12個循環(huán)；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，25個循環(huán)（每個循環(huán)增加1 s）；72℃10 min；4℃終止反應(yīng)。將選擇性擴增產(chǎn)物在PCR儀中95℃變性8 min后立即置于冰水混合物中，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離變性產(chǎn)物，銀染參照Bassam等方法[8]，銀染后進行分析。

1.3.5 種質(zhì)資源篩選

利用E13M08標(biāo)記對70份種質(zhì)資源進行鑒定，并與田間表型鑒定結(jié)果結(jié)合分析，獲得有應(yīng)用價值的種質(zhì)資源。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間果型鑒定

觀察供試材料在果實成熟期的田間表型。經(jīng)鑒定表明，兩個親本間果實表現(xiàn)差異明顯，父本表現(xiàn)為皺褶型果實，母本表現(xiàn)為光滑型果實，F(xiàn)1代雜交群體均表現(xiàn)為光滑型果實，F(xiàn)2代分離群體果實光滑型與皺褶型實際比例為3.174∶1，x2檢測符合3∶1的分離比例。分析結(jié)果表明，母本12509中所含F(xiàn)基因符合單基因顯性遺傳規(guī)律。

表2 不同世代試驗材料F基因的遺傳分析Table 2 Genetic analysis of F gene in different generation

2.2 AFLP分子標(biāo)記篩選及分析

利用父本（12510）與母本（12509）對256對AFLP引物進行篩選，獲得82對差異性引物（見圖2），詳細引物見表3，利用果實光滑與皺褶的果型基因池進行復(fù)選，篩選出33對差異較顯著的AFLP引物（見圖3）。使用篩選出33對引物對F2代分離群體共288株試驗材料分別進行擴增，詳細引物見表4。對擴增結(jié)果進行記錄，有帶記為“1”，無帶記為“0”（見圖4），應(yīng)用JoinMap4.0軟件分析試驗數(shù)據(jù)，確定遺傳連鎖距離（cM），得到6個連鎖標(biāo)記：E13M08、E11M07-B、E11M12-D、E11M08-A；E01M10和E10M16-E，連鎖遺傳距離分別為6.4、8.5、10.9、17.1、23.5和24.2 cM，AFLP分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜見圖5。

圖212509 ×12510群體篩選的部分AFLP引物Fig.2 Screening AFLP primers on 12509×12510 population

圖3 混合基因池篩選出的部分AFLP特異性引物Fig.3 Screening AFLP primers on mix pool

表3 從親本中篩選到的特異引物Table 3 Screening the specific primers from 12509 and 12510

表4 用于群體F2單株選擇性擴增的特異引物Table 4 Primers used in amplication of F2individual plants of 12509×12510

圖4 引物E13M08在部分F2群體中的AFLP擴增結(jié)果Fig.4 AFLP PCR amplification results using E13M08 primers in partial F2population

圖5 AFLP分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜Fig.5 Genetic linkage map of AFLP markers

2.3 種質(zhì)資源篩選

對70份種質(zhì)資源進行田間表型鑒定和分子標(biāo)記鑒定，田間表型鑒定70份材料中有50份為光滑品種，應(yīng)用E13M08標(biāo)記對70份種質(zhì)資源進行篩選，二者結(jié)果吻合的品種為45份，吻合率為90%。具體見表5。

表5 F2代分離群體中部分單株的分子鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果Table 5 Result of molecular identification and field in partial F2population

3 討論與結(jié)論

經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為控制果實光滑性狀F基因符合單基因顯性遺傳規(guī)律，而Barrero等認(rèn)為控制此性狀是由主效基因和多個微效基因共同作用，為數(shù)量遺傳[9]。試驗通過對親本、F1代雜交群體及F2代分離群體進行田間果型鑒定，父本表現(xiàn)為皺褶型果實，母本表現(xiàn)為光滑型果實，F(xiàn)1代雜交群體均表現(xiàn)為光滑型果實，F(xiàn)2代分離群體果實光滑型與皺褶型比例接近3∶1，F(xiàn)基因符合單基因顯性遺傳規(guī)律。

目前分子標(biāo)記技術(shù)因選育周期短、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點而被應(yīng)用于番茄品質(zhì)育種工作中，其中AFLP分子標(biāo)記技術(shù)可靠性強、多態(tài)性高、可重復(fù)性較好、條帶豐富清晰，被認(rèn)為是有效分子標(biāo)記技術(shù)，本試驗通過利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，獲得6個與果實光滑基因F相連鎖分子標(biāo)記，且有兩個標(biāo)記（E13M08、E11M07-B）在10 cM以內(nèi)，可用于分子遺傳育種，在種質(zhì)資源篩選過程中，分子鑒定結(jié)果與田間表型鑒定結(jié)果差異性顯著，除環(huán)境或人為原因外，也可能E13M08標(biāo)記與F基因連鎖不緊密，這與試驗材料親緣關(guān)系有關(guān)，還有待于篩選連鎖更為緊密的分子標(biāo)記，為今后分子育種工作奠定基礎(chǔ)。

[1]Cong B,Barrero L S,Tanksley S D.Regulatory change in YABBY like transcription factor led to evolution of extreme fruit size dur?ing tomato domestication[J].Nature Genetics,2008,40(6):800-804.

[2]Ronen G,Carmel-Goren L.An alternative pathway to β-carotene formationin plant chromoplasts discovered by map-based cloning of beta and old-gold color mutation in tomato[J].PNAS,2000,97 (20):11102-11107.

[3]李紅雙,李景富,許向陽.番茄抗根結(jié)線蟲病基因的RAPD和SCAR標(biāo)記[J].植物病理學(xué)報,2006,36(2):185-188.

[4]許向陽.番茄葉霉病抗病基因Cf-11、Cf-19的分子標(biāo)記研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[5]Williamson V M,Ho J Y,Wu F F,et al.A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene,Mi,in tomato[J]. Theoretical and Applied Genetics,1994,87:757-763.

[6]Michelmore R W,Paran I,Kesseli R V.Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analyses: A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J].Proceedings of the National Academy of the United States of America,1991,88:9828-9832.

[7]Vos P,Hogers R,Bleeker M.AFLP:A new technique for DNA fin?gerprinting[J].Nucleic Acids Research,1995,23:4407-4414.

[8]Bassam B J,Caetano Anollés G,Gresshoff P M.Fast and sensitive silver staining ofDNA in polyacrylamide gels[J].Anal Biochem, 1991,196:80-83.

[9]Barrero L S,Tanksley S D.Evaluating the genetic basis of multi?ple-locule fruit in a broad cross section of tomato cultivars[J]. Theor Appl Genet,2004,109:669-679.

Screening of molecular markers linked to fruit smoothFgene intomato and identification of germplasm resource/

XU Xiangyang,YU Tingting, ZHAO Tingting,LI Shuai,JIANG Jingbin,ZHANG He,LI Jingfu(School of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Study identified the molecular marker linked to smooth fruitFgene of tomato.The linked marker was screened with a F2population between a smooth and fasciated parent（12509×12510）by AFLP technology.Total six AFLP markers had been identified to linked withFgene,E13M08,E11M07-B, E11M12-D,E11M08-A,E01M10 and E10M16-E.The genetic distances were 6.4,8.5,10.9,17.1,23.5 and 24.2 cM,respectively.AFLP marker E13M08 was used for the screening of germplasm resources.We obtained 45 cultivars which contained this marker.The study provided the basis for the appearance quality of tomato breeding.

tomato;fruit;Fgene;AFLP;germplasm resource

S641.2

A

1005-9369（2014）06-0032-06

時間 2014-6-11 16:08:56 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140611.1608.007.html

許向陽,于亭亭,趙婷婷,等.番茄果實光滑基因F的分子標(biāo)記篩選及種質(zhì)資源鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(6):32-37.

Xu Xiangyang,Yu Tingting,Zhao Tingting,et al.Screening of molecular markers linked to fruit smoothFgene in tomato and identification of germplasm resource[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(6):32-37.(in Chinese with English abstract)

2013-12-06

國家自然科學(xué)基金（31272171）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（CARS-25）；黑龍江省杰出青年科學(xué)基金（JC201204）

許向陽（1969-），男，研究員,博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為蔬菜遺傳育種。E-mail:xxy709@126.com