陳啟乾, 李 艷
(1. 貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科,貴州 貴陽550001;2. 貴州中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科,貴州貴陽550001)
華佗再造丸收載于《中國藥典》2010 年版一部[1],由吳茱萸、川芎、冰片等藥味經(jīng)加工制成的濃縮水蜜丸,具有活血化癖、化痰通絡(luò)、行氣止痛之功效,用于痰瘀阻絡(luò)之中風(fēng)恢復(fù)期和后遺癥,癥見半身不遂、拘攣麻木、口眼歪斜、言語不清,臨床應(yīng)用廣泛,療效確切[2]。 《中國藥典》2010 年版僅收載有華佗再造丸的薄層鑒別和檢查項目,缺乏對處方主藥的含量測定項目[1],未達到真正對華佗再造丸內(nèi)在質(zhì)量進行全面控制的要求。通過查閱文獻[3-4],目前也僅有采用高效液相色譜法測定華佗再造丸中阿魏酸、吳茱萸堿等單一成分的報道。本實驗采用UPLCMS/MS 建立了同時快速、高靈敏測定華佗再造丸中阿魏酸和吳茱萸堿的新方法,國內(nèi)外未見相關(guān)文獻報道,為進一步完善華佗再造丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實驗依據(jù)。
ACQUITYTM系統(tǒng)超高液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters 公司,包括二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站);阿魏酸(批號110773-9910)和吳茱萸堿(批號110802-200504)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所;華佗再造丸(市售品,廣州奇星藥業(yè)有限公司,規(guī)格80 g/瓶,批號見表2)。乙腈、甲酸為色譜純;水為純凈水;其他試劑均為分析純。陰性樣品自制。
2.1 分析條件 色譜條件 WATERS ACQUITY BEH Cl8色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm);流動相A 為乙腈,B為5 mmol/L 甲酸銨水溶液,梯度洗脫,0 ~6 min,流動相A 5% ~35%;6 ~10 min,流動相A 35% ~95%;體積流量為0.4 mL/min;柱溫為45 ℃;進樣量為2 μL。
質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI);毛細管電壓4 KV,離子源溫度125 ℃,干燥氣溫度360 ℃,干燥氣體積流量900 L/h;停留時間(Dwell)0.2 s;CV:30 (阿魏酸)、26 (吳茱萸堿);Ce:25 (阿魏酸)、30 (吳茱萸堿);用于定量分析的離子對為m/z (-)193.2 →134.3 (阿魏酸)、m/z (+)304.1→287.9 (吳茱萸堿)。
2.2 供試品溶液及陰性對照溶液的制備 稱取本品10 g,粉碎,過二號篩,混勻,取1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)60 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,離心,取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。同法,制得缺川芎、吳茱萸的陰性對照溶液。
2.3 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品10.2 mg和吳茱萸堿對照品12.5 mg,分別置于100 mL 量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,精密吸取上述對照品溶液各5 mL 置同一25 mL 量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,制成阿魏酸和吳茱萸堿質(zhì)量濃度分別為20.4 μg/mL 和25.0 μg/mL 的混合對照品溶液。
2.4 專屬性試驗 取混合對照品溶液、陰性對照品溶液和供試品溶液,在上述分析條件下分別進樣測定,結(jié)果見圖1 ~2。由圖可知,供試品溶液中被測定化合物與2 個對照品的保留時間相同。比較被測定成分和對照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖,兩者一致,且陰性樣品對阿魏酸和吳茱萸堿的測定無干擾,樣品檢測介質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果不影響測定,表明本法專屬性良好。
圖1 對照品溶液(A)樣品溶液(B)陰性樣品溶液(C)色譜圖
圖2 被測成分阿魏酸(A)和吳茱萸堿(B)質(zhì)譜圖
2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述混合對照品溶液,依次用甲醇逐級稀釋,制得6 個系列質(zhì)量濃度線性工作液,分別進樣測定。以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo),以對照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進行線性回歸,阿魏酸和吳茱萸堿的線性回歸方程分別為:Y =4 934 909X -7 794,r =0.999 9;Y=7 287 380X-11 541,r=0.999 6;結(jié)果表明阿魏酸和吳茱萸堿質(zhì)量濃度分別在0.64 ~10.20 μg/mL 和0.79 ~25.00 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
2.6 精密度試驗 取混合對照品溶液重復(fù)進樣6 次,測定峰面積。阿魏酸和吳茱萸堿峰面積的RSD (n = 6)為1.2%,0.8%。結(jié)果表明,儀器精密度良好。
2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批華佗再造丸樣品(批號1125),共6 份,按“供試品溶液”項下方法操作,在上述色譜條件下進樣,阿魏酸和吳茱萸堿的平均含量(n =6)分別為0.083 mg/g 和0.152 mg/g;RSD (n =6)分別為1.7%和2.5%。結(jié)果表明,重復(fù)性良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一華佗再造丸供試品溶液,分別在0、1、2、4、8、12 h 進樣分析,測得阿魏酸和吳茱萸堿峰面積的RSD (n=6)分別為2.2%和1.6%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.9 回收率試驗 精密稱取6 份已知含有量的華佗再造丸樣品(批號1125)約0.5 g,分別精密加入8.64 μg/mL 阿魏酸和14.32 μg/mL 吳茱萸堿混合對照品溶液5 mL,按供試品溶液的制備方法制得供試品溶液,分別進樣測定,計算回收率及RSD,結(jié)果見表1。
表1 回收率測定結(jié)果(n=6)
2.10 樣品測定 取3 批華佗再造丸,按照“2.2”項下處理后,精密吸取對照品溶液及供試品溶液各1 μL,依上述色譜質(zhì)譜條件測定,測定結(jié)果見表2。
表2 樣品測定結(jié)果(mg/丸)
川芎是華佗再造丸方中主藥,阿魏酸為川芎的活性成分之一,具有抗血小板聚集,抑制血小板5-羥色胺釋放,鎮(zhèn)痛,緩解血管痙攣等作用[5]。吳茱萸堿是華佗再造丸處方中吳茱萸中的一種重要生物堿成分,具有舒張血管、鎮(zhèn)痛、利尿、抗菌、抗腫瘤等作用[6]。因此,本實驗結(jié)合華佗再造丸處方主藥的化學(xué)成分及其藥理作用,選擇阿魏酸和吳茱萸堿作為其質(zhì)量控制指標(biāo)。
華佗再造丸為中藥復(fù)方制劑,處方藥味較多,成分復(fù)雜,且阿魏酸和吳茱萸堿在制劑中含量較低,在試驗過程中曾采用HPLC 對其定量,結(jié)果不甚理想。液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)由于專屬性強、靈敏度高,已經(jīng)越來越多的被應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制研究中[7-8]。經(jīng)比較研究,本實驗采用UPLC-MS/MS 法對華佗再造丸中阿魏酸和吳茱萸堿含量進行同時測定,可最大限度地排除其它成分的干擾,簡化操作,提高測定精密度,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,方法合理可行,可用于華佗再造丸的質(zhì)量控制。
[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:693.
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