HPLC 法同時測定錦燈籠果實中5 種成分及等級鑒定

徐保利， 李先寬， 王 冰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連116600)

錦燈籠為茄科植物酸漿Physalis alkekengi L.var. franchetii (Mast.)Makino 的干燥宿萼或帶果實的宿萼。秋季果實成熟、宿萼呈紅色或橙紅色時采收，干燥，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、強(qiáng)心、利尿及抗癌等作用［1］，其中黃酮類和酸漿苦素類成分在現(xiàn)在藥理研究中已被證明具有抗炎活性［2-3］?！吨袊幍洹?010 年版對錦燈籠藥材的質(zhì)量規(guī)定為本品按干燥品計算，含木犀草苷不得少于0.10%［4］。

近些年對錦燈籠的化學(xué)成分及質(zhì)量研究主要在錦燈籠的宿萼部分［5-7］，對其果實的研究較少［8］。中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，目前對單一化學(xué)成分的測定并不能全面評價藥材質(zhì)量，對多種成分的同時測定可以較全面的評價中藥質(zhì)量［9-11］。因此本實驗利用高效液相色譜法對錦燈籠果實中的5 種成分進(jìn)行了測定方法的研究，并對不同產(chǎn)地的錦燈籠果實進(jìn)行了測定，同時對所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，為今后錦燈籠的藥材的應(yīng)用，尤其是果實部位的應(yīng)用和質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100 HPLC (美國Agilent 公司);KQ3200B 型超聲清洗器(江蘇昆山)。

1.2 試劑 甲醇 (分析純，天津星月，批號20101126);甲醇 (HPLC 級，天津大茂，批號20101214);乙腈 (HPLC 級，天津大茂，批號20100326);磷酸(HPLC 級，天津科密歐，批號20100328);水為超純水。

1.3 對照品 木犀草苷(貴州迪大科技有限公司，批號20090928);木犀草素(中國食品藥品檢定研究院，批號111520-200504);酸漿苦素A、O由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許枬老師自制，酸漿苦素P 由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)許亮老師自制，經(jīng)歸一化法檢測純度均大于98%。

1.4 藥材 采集及購買于黑龍江、吉林、遼寧、山西、山東及安徽6 省共60 份，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為茄科酸漿屬植物酸漿的果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品木樨草苷3.25 mg，木犀草素2.50 mg，酸漿苦素A 3.00 mg，酸漿苦素P 2.50 mg 和酸漿苦素O 4.50 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為130 、100、120 、100、180 μg/mL 的單一對照品貯備液。精密吸取上述對照品貯備液各1.0、1.0、1.0、1.0和5.0 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，制成混合對照品溶液。

2.2 樣品制備 將干燥的錦燈籠果實粉碎成粉末過50 目篩，稱取1 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加25 mL 甲醇，超聲1 h，濃縮定容至15 mL 量瓶中，備用。

2.3 色譜條件 Agilent TC-18 (4.6 mm×150 mm，5 μm);UV 檢測器;柱溫30 ℃;體積流量1.0 mL/min;檢測波長為350 nm (0 ～24 min)，220 nm (24 ～37 min);進(jìn)樣量20 μL;流動相為0.2%磷酸 (A)-乙腈 (B)，梯度洗脫 (0 ～13 min，20%→23%B;13 ～37 min，23%→31%B)。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)及供試品(B)HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances (A)and samples (B)

2.4 線性關(guān)系考察 分別將木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 用甲醇配置成一定濃度的對照品溶液，見表1。分別精密吸取4、8、12、16、20 μL按“2.2”項色譜條件檢測，記錄峰面積，以對照品量為橫坐標(biāo) (X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Calibration curve and linear range

2.5 精密度考察 精密量取木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 的混合對照品溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，RSD 分別為0.9%、1.2%、0.8%、0.8%、1.1%。

2.6 重復(fù)性試驗 取干燥錦燈籠果實樣品1.0 g，共6 份，精密稱定，按“2.1”項下制備方法進(jìn)行制備，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC 分析。根據(jù)所得5 種成分的峰面積計算其在樣品中的量。結(jié)果果實中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 的RSD 值分別為1.3%、1.1%、1.0%、1.2% 和0.9%。試驗表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，測得樣品中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O的RSD 值分別為1.1%、1.0%、1.3%、1.0%和1.3%。試驗表明，樣品中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率考察 稱取遼寧省鐵嶺市西豐縣尚文村柳河屯樣品1 g，精密稱定，平行6 份，每份分別精密加入木犀草苷1.40 μg/mL、木犀草素10 μg/mL、酸漿苦素A 50 μg/mL、酸漿苦素P 5 μg/mL、酸漿苦素O 18 μg/mL 各1 mL，按“2.1”項下制備方法進(jìn)行制備，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，分別測定，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests (n=6)

2.9 統(tǒng)計分析 利用SPSS 18.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行K-均值聚類分析，K-均值聚類分析算法首先隨機(jī)從數(shù)據(jù)集中選取K 個點作為初始聚類中心，然后計算各個樣本到聚類中的距離，把樣本歸到離它最近的那個聚類中心所在的類。計算新形成的每一個聚類的數(shù)據(jù)對象的平均值來得到新的聚類中心，如果相鄰兩次的聚類中心沒有任何變化，說明樣本調(diào)整結(jié)束，聚類準(zhǔn)則函數(shù)已經(jīng)收斂。

2.10 結(jié)果 按照“2.1”項下對不同產(chǎn)地及來源地的錦燈籠果實進(jìn)行制備，并按照“2.2”項下進(jìn)行檢測，其結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

3.1 在190 ～400 nm 波長范圍內(nèi)，對木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 單獨(dú)對照液和混合對照液進(jìn)行波長掃描，發(fā)現(xiàn)木犀草苷、木犀草素在220 nm 和350 nm 處有較好吸收，而酸漿苦素A、P 和O 在220 nm 處有較好吸收，但木犀草苷和木犀草素在220 nm 處的干擾峰較多，因此本研究采用切換波長的方法對錦燈籠藥材的5 種成分進(jìn)行檢測。本研究采用了多種流動相，最終確定以0.2%磷酸水-乙腈為流動相，加入磷酸水使基線平穩(wěn)，樣品峰與其他峰能達(dá)到基線分離。

3.2 錦燈籠果實中的木犀草素、酸漿苦素P 和O的量過低，在絕大多數(shù)樣品中無法檢測，因此在做方法學(xué)考察時，利用其對照品的混合溶液進(jìn)行，并對錦燈籠果實樣品中的木犀草苷和酸漿苦素A 進(jìn)行考察。

表3 不同產(chǎn)地錦燈籠果實化學(xué)成分測定及分級結(jié)果(μg/g)Tab.3 Results of chemical composition determination and classification for Physalis calyx seu Fructus from different growing areas (μg/g)

續(xù)表3

3.3 借鑒前期對錦燈籠宿萼有效成分測定的結(jié)果［12］，錦燈籠果實中木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、O 和P 的量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于錦燈籠宿萼中的量，而《中國藥典》2010 年版規(guī)定錦燈籠藥材為酸漿成熟的宿萼或帶果實的宿萼，由于其果實為漿果且富含糖類，易招蟲蛀，不宜干燥，因此不建議將錦燈籠的藥用部位定位為果實，僅保留宿萼部分。

3.4 錦燈籠果實在實際應(yīng)用中并無分級標(biāo)準(zhǔn)，因此本實驗利用不同產(chǎn)地錦燈籠果實HPLC 檢測所得的結(jié)果對錦燈籠果實進(jìn)行質(zhì)量分級處理。因為錦燈籠果實中的木犀草素、酸漿苦素P 和O 含有量過低，在絕大多數(shù)樣品中無法檢測，所以將木犀草苷、酸漿苦素A 及木犀草苷、木犀草素、酸漿苦素A、P 和O 總量定為錦燈籠果實的分級標(biāo)準(zhǔn)，利用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件采用K-均值聚類分析方法，暫定為3 級，見表4 和表5。由表6 的方差分析結(jié)果可以看出木犀草苷、酸漿苦素A 及總量均達(dá)到了極顯著水平，因此三者均可作為錦燈籠果實分級標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)。以酸漿苦素A 作為分級指標(biāo)，對所有樣品進(jìn)行分級處理，結(jié)果見表3，以酸漿苦素A作為分級指標(biāo)，其對于錦燈籠果實的專屬性更強(qiáng)，更能從藥材基源及質(zhì)量方面反映錦燈籠果實的藥材質(zhì)量。

表4 K-均值聚類分析的最終類中心值(μg/g)Tab.4 Final center value for K-means clustering analysis(μg/g)

表5 錦燈籠果實分級標(biāo)準(zhǔn)(μg/g)Tab.5 Physalis calyx seu Fructus classification standard(μg/g)

表6 錦燈籠果實分級指標(biāo)的方差分析結(jié)果Tab.6 Results of index variance for the Physalis calyx seu Fructus grading

［1］ 王明東，楊松松. 錦燈籠化學(xué)成分及藥理作用綜述［J］.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，7(5):341-342.

［2］ Ji L，Yuan Y，Luo L，et al. Physalins with anti-inflammatory activity are present in Physalis alkekengi L. var. franchetii and function as Micheal reaction acceptors［J］. Steroids，2012，77(5):441-447.

［3］ Vieira A T，Pinho V，Lepsch L B，et al. Mechanisms of the anti-inflammatory effects of the natural secosteroids physalins in a model of intestinal ischaemia and reperfusion injury［J］. Br J Pharmacol，2005，146(2):244-251.

［4］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:337.

［5］ 徐保利，王 冰. 遼寧各地酸漿宿存萼中木犀草素含量測定［J］. 山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，9(1):50-51.

［6］ 施 蕊，賈凌云，孫啟時，等. RP-HPLC 測定酸漿藥材中3 種有效成分的含量［J］. 藥物分析雜志，2008，28(2):260-262.

［7］ 邱 莉，姜志虎，劉紅霞，等. 酸漿宿萼的黃酮苷類化學(xué)成分［J］. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2007，24(12):744-747.

［8］ 于 婷，劉玉強(qiáng)，暮春旭，等. 錦燈籠果實中4，7-二脫氫新酸漿苦素B 的含量測定［J］. 遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(4):584-585.

［9］ 黃茲英，王繼良，黃敏潔，等. HPLC 法同時測定夏枯草中蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚［J］. 中成藥，2012，34(3):520-523.

［10］ 胡俊揚(yáng)，陸兔林，毛春芹，等. HPLC 法同時測定不同產(chǎn)地五味子中8 種木脂素類成分［J］. 中成藥，2012，34(2):313-316.

［11］ 李 妍，楊燕云，張振秋，等. HPLC 法同時測定白芍、甘草藥對提取物中9 種有效成分［J］. 中成藥，2013，35(1):100-104.

［12］ Xu Baoli，Ju Chengguo，Guan Huijie，et al. HPLC determination of five active ingredients in the calyces of Physalis Alkekengi L. var. franchetii (mast.)Mskino［J］. J Med Plants Res ，2012，6(12):2438-2442.