止痛止癢類中成藥中非法添加化學藥物的快速鑒定方法

吳曉敏， 史大軍* ， 王明娟， 李 奎， 孫 熹， 唐新月

(1. 三峽食品藥品檢驗檢測中心，湖北宜昌443005;2. 中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

良好的中藥制劑因為安全、不良反應(yīng)少，長期以來受到人們信賴，是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥發(fā)展的優(yōu)勢。但多種中藥制劑與化學藥相比，往往作用溫和，起效慢。為了增強中藥制劑短期療效，將一些化學藥品加入到治療風濕、類風濕等疾病的止痛止癢類的中成藥和保健食品中［1］，由于這些化學藥物都有明顯的不良反應(yīng)，患者在不知情的情況下長時間使用后，有可能產(chǎn)生嚴重的后果，危害身體健康。中藥制劑的非法添加已引起相關(guān)部門高度重視，但由于中藥制劑中所含成分復雜、質(zhì)量標準還不完善，國內(nèi)雖有一些相關(guān)的文獻報道［2-3］，但目前還沒有鑒定非法添加微量糖皮質(zhì)激素和鎮(zhèn)痛藥的法定方法，為了快速準確地鑒定出藥物中是否非法添加此類化學藥成分，本實驗建立了以TLC 方法進行初篩，對疑似樣品進一步采用HPLC 方法確證，一次能夠測定6 種糖皮質(zhì)激素(醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、醋酸可的松、倍他米松、潑尼松)和2 種鎮(zhèn)痛藥(雙氯芬酸鈉、吲哚美辛)的篩查方法，并用市售的14 種止痛止癢類中成藥對該法進行驗證，證實該方法快速、簡便、專屬性強、可滿足基層藥品現(xiàn)場打假的需求。

1 儀器與試藥

Waters 高效液相色譜儀，配備型號為2998 的二極管陣列檢測器;(高效)硅膠G 薄層板，青島海立倍精細硅膠化工有限公司(批號20100818);(高效)硅膠GF254薄層板，天津思利達科技有限公司(批號100628)。

醋酸潑尼松(批號100012-200706)、醋酸氟輕松(批號10010-02061)、醋酸地塞米松(批號100122-200805)、 倍 他 米 松 (批 號 100118-200403)、醋酸可的松(批號100123-200303)、潑尼松(批號100199-201002)、雙氯芬酸鈉(批號100334-200302)、吲哚美辛(批號0258-9501)對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供;二氯甲烷、甲醇、乙醚、正己烷、乙酸乙酯均為分析純;水為純化水;四氮唑藍為進口試劑(東京化成工業(yè)株式會社)。

14 種止痛止癢類中成藥均為市售:克痹骨泰膠囊 (批號 100201)，風濕安泰片 (批號20080401)，風痛安膠囊(批號20080501)，豨薟風濕膠囊(批號090408)，清新百合紫蘇膠囊(批號20110102)，風痛片(批號110302)，風濕馬錢片(批號20100105)，麝香關(guān)節(jié)止痛膏 (批號121002)，骨友靈貼膏(批號120701)，萬通筋骨貼 (批 號 120813)，復 方 樟 腦 乳 膏 (批 號201207030)，好百夫康軟膏(批號120701)，腰間盤突出止痛貼(批號2012301)，風濕骨痛貼(批號20111201)。

2 薄層色譜初篩方法

2.1 薄層色譜條件

2.1.1 薄層色譜方法1 (用于鑒別糖皮質(zhì)激素類的6 種化學藥品) (高效)硅膠G 薄層板;展開劑為二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385 ∶70 ∶14 ∶2);點樣量4 μL;分別量取10 mL 0.3%四氮唑藍甲醇溶液與30 mL 12%氫氧化鈉甲醇溶液，臨用時混勻作為顯色劑。分別取供試品溶液和對照品溶液1 各4 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，展開后，晾干，置105 ℃加熱15 min，噴以四氮唑藍顯色劑，檢視［4］。

2.1.2 薄層色譜方法2 (用于鑒別雙氯芬酸鈉和吲哚美辛2 種化學藥品) (高效)硅膠GF254薄層板;展開劑為正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5);點樣量4 μL;置紫外光燈254 nm 下檢視。分別取供試品溶液和對照品溶液2 各4 μL，點于同一硅膠GF254薄層板，展開后，晾干，置紫外光燈254 nm 下檢視。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 膠囊劑和片劑 取1 次口服用量的供試品(片劑研磨后取細粉適量)，加甲醇10 mL，超聲振搖提取(150 W，55 kHz)15 min，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 軟膏劑 取樣品1 g，加甲醇20 mL 微溫至50 ℃，振搖溶解，充分冷卻后過濾，取濾液作為供試品溶液。

2.2.3 貼膏劑和膏藥 取樣品2 片，剪成窄條，除去蓋襯，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，加熱回流1 h，放冷，過濾，濾液蒸干濃縮至10 mL，作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

2.3.1 糖皮質(zhì)激素類對照品溶液 分別稱取醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、潑尼松對照品各20 mg，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，作為對照品溶液1;另外，取醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、潑尼松對照品各20 mg，分別置6 個10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、潑尼松對照品溶液。

2.3.2 雙氯芬酸鈉和吲哚美辛對照品溶液 取雙氯芬酸鈉對照品和吲哚美辛對照品各20 mg，置同一10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液2;取雙氯芬酸鈉對照品和吲哚美辛對照品各20 mg，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為雙氯芬酸鈉對照品溶液和吲哚美辛對照品溶液。

2.4 陽性對照溶液的配制 取1 次口服用量的供試品，分別加入步驟“2.3”項所得的對照品溶液5 mL，按“2.2”項下制備，作為供試品陽性對照溶液。

3 高效液相色譜確證方法

3.1 色譜條件 SunFire C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm;Waters 公司);柱溫25 ℃;流動相A 為0.5%HAc 溶液-四氫呋喃(100 ∶1)，流動相B 為乙腈-0.5% HAc 溶液-四氫呋喃(80 ∶20 ∶1)，按表1 進行梯度洗脫;檢測波長254 nm，二極管陣列檢測器檢測，掃描波長范圍190 ～450 nm［6-7］;體積流量1 mL/min。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Linear gradient manmer

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液 精密稱取醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、潑尼松對照品各25 mg，分別置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液3;精密稱取雙氯芬酸鈉對照品、吲哚美辛對照品各25 mg，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解后稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液4。分別精密量取上述2 種對照品貯備液各2 mL，置50 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

3.2.2 供試品溶液

3.2.2.1 膠囊劑和片劑 取1 次口服劑量的供試品(片劑研磨后取細粉適量)，置50 mL 量瓶，加甲醇約20 mL，超聲振搖提取15 min，加甲醇稀釋至刻度，混勻，過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液。

3.2.2.2 貼膏劑和膏藥 取供試品貼膜2 片，剪成窄條，除去蓋襯，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液［2］。

4 結(jié)果與討論

4.1 薄層色譜初篩方法的建立

4.1.1 薄層色譜方法1 分別吸取醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、潑尼松對照品溶液和對照品溶液1 各4 μL，點于同一薄層板上，按“2.1.1”項薄層色譜方法1 進行系統(tǒng)適用性試驗，置預先放有展開劑的層析缸中，展開，取出，晾干，顯色后檢視，結(jié)果見圖1A?？梢姼鱾€對照品的比移值(從左至右)分別為0.25、0.64、0.54、0.47，0.72 和0.15，均在0.15 ～0.8 之間，各個斑點可清晰分離。分別吸取對照品溶液1 各8、6、4、2、1 μL 進行試驗，確定方法的最低檢出限，其中點樣量1 μL 時斑點仍可清晰辨認，醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、倍他米松、醋酸可的松、潑尼松的最低檢測質(zhì)量濃度均約為0.1 mg/mL。分別吸取供試品溶液、對照品溶液和供試品陽性對照溶液各4 μL，進行試驗，結(jié)果見圖1B。可見在與對照品溶液斑點對應(yīng)處供試品溶液無斑點顯現(xiàn)，供試品陽性對照溶液顯現(xiàn)的斑點與對照品溶液的斑點一致，即方法可以篩查出樣品中非法添加的化學藥。

圖1 系統(tǒng)適用性實驗(A)和實際樣品檢測結(jié)果(B)Fig.1 TLC of system suitability test (A)and TLC of the actual sample testing results (B)

4.1.2 薄層色譜方法2 比較了二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5)、二氯甲烷-乙醚-甲醇-水(385 ∶70 ∶14 ∶2)和正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5)3 種展開劑［5］，前2 種展開劑分別出現(xiàn)了拖尾和無法分離的現(xiàn)象，在正己烷系統(tǒng)展開劑中，2 個對照品的比移值分別為0.42 和0.55，且對照品的斑點清晰分離見圖2A，所以采用了正己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(30 ∶10 ∶0.5)作為展開劑。分別吸取上述對照品溶液8、6、4、2、1 μL點于薄層板上，其中點樣量1 μL 時，對照品的斑點清晰辨認，雙氯芬酸鈉和吲哚美辛的最低檢測濃度約為0.1 mg/mL。分別吸取供試品溶液、對照品溶液和供試品陽性對照溶液各4 μL 進行試驗，結(jié)果見圖2B，結(jié)果表明，樣品基質(zhì)不干擾目標化合物(雙氯芬酸鈉和吲哚美辛)的測定。

圖2 系統(tǒng)適用性實驗(A)和實際樣品檢測結(jié)果(B)Fig.2 TLC of system suitability test (A)and TLC of the actual sample testing results (B)

由于醋酸潑尼松和醋酸地塞米松對照品斑點距離較近，實驗中發(fā)現(xiàn)乙醚的質(zhì)量影響兩斑點的分離。本實驗在室溫20 ～25 ℃環(huán)境與在 (10 ±1)℃、(15 ±1)℃及(30 ±1)℃的環(huán)境下試驗結(jié)果一致，只是隨著溫度降低展開時間延長。如采用高效薄層板，展開時間較普通硅膠薄層板短，規(guī)格為10 cm ×20 cm 的普通薄層板展開時間約為60 ～70 min，規(guī)格為10 cm ×10 cm 的高效薄層板展開時間約為20 min 且顯色更加明顯、均勻易辨識。

對貼膏劑和膏藥的前處理方法直接影響檢測結(jié)果。曾嘗試超聲提取的方法，超聲時間分別為30 min和60 min，但腰間盤止痛貼采用超聲方法所得溶液中成分含有量僅為回流提取方法的40%，故最終選用了加熱回流的提取方法。

4.2 高效液相色譜確證方法的建立

4.2.1 流動相的選擇 預實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):流動相中加入四氫呋喃能加強洗脫，調(diào)整峰形;另外，雙氯芬酸鈉和吲哚美辛在水相中會出現(xiàn)明顯拖尾，無法檢出，加入適量濃度的冰醋酸能調(diào)整雙氯芬酸鈉與吲哚美辛的色譜峰的峰形［8-10］。當冰醋酸為0.5%時，上述2 個色譜峰無拖尾現(xiàn)象，且各組分均能完全分離，分離度均在1.5 以上，見圖3。在所建立的色譜系統(tǒng)條件下，各對照品的出峰順序依次為潑尼松、倍他米松、醋酸潑尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸氟輕松、吲哚美辛、雙氯芬酸鈉，保留時間分別為:13、17、21、22、24、31、34 和35 min;分離度分別為11.8、14.5、1.9、6.7、13.2、6.9、2.0。

圖3 對照品溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of reference solution

4.2.2 方法學驗證

4.2.2.1 精密度試驗 取對照品溶液重復進樣5次，記錄色譜圖，測得8 種對照品的保留時間變化為0.1 min，8 種對照品峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.7% ～1.1%。

4.2.2.2 重復性試驗 取同一陽性供試品5 份，制備供試品溶液分別測定峰面積，結(jié)果添加成分含有量為0.62 mg/粒，RSD (n=5)為1.7%，表明本法重復性良好。

4.2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液和陽性供試品溶液于0、4、8、12、24 h 分別進樣測定，記錄色譜圖，對照品溶液中各成分峰面積的RSD 均小于1.5%，供試品溶液中峰面積的RSD 為1.2%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

4.2.2.4 線性范圍和最低定量限檢出限 取6 種糖皮質(zhì)激素對照品貯備液分別稀釋成0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL 的混合對照溶液依次進樣，以峰面積對溶液質(zhì)量濃度作標準曲線，另取雙氯芬酸鈉和吲哚美辛對照貯備液分別稀釋 成 2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04 mg/mL 的混合對照溶液依次進樣，以峰面積對溶液質(zhì)量濃度作標準曲線，結(jié)果潑尼松為Y =3.66 ×10-5x+0.902 4，r=0.999 9;倍他米松Y=4.15 ×10-5x +0.832 8，r =0.999 9;醋酸潑尼松Y=4.43 ×10-5x+0.120 7，r=0.999 9;醋酸可的松Y=4.04 ×10-5x +0.622 6，r =0.999 9;醋酸地塞米松Y=4.47 ×10-5x+0.874 0，r=0.999 9;醋酸氟輕松Y=5.62 ×10-5x +0.414 8，r =0.999 9;雙氯芬酸鈉Y=7.96 ×10-5x +3.149 5，r=0.999 9;吲哚美辛Y=2.93 ×10-5x -7.220 0，r =0.999 8。8 種對照品均呈線性關(guān)系且相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999，線性關(guān)系良好。取混合對照溶液稀釋后按試驗方法檢測，得到各組分的定量限(S/N≥10)，醋酸氟輕松對照品為2 μg，其余對照均為1 μg。

4.2.2.5 加樣回收試驗 陰性加標溶液的制備:取同一陰性供試品6 份，另精密稱取對照品按“3.2.1”項下制備對照品貯備液，將樣品按供試品方法項下制備并分別加入上述對照品貯備液2 mL，用外標法進行測定并計算回收率，平均回收率(n =6)為潑尼松99.4%，RSD 為0.3%;倍他米松100.5% ，RSD 為0.5%;醋酸潑尼松98.3%，RSD 為0.5%;醋酸可的松98.5%，RSD為0.7%;醋酸地塞米松99.7%，RSD 為0.6%;醋酸氟輕松99.1%，RSD 為0.5%;吲哚美辛99.6%，RSD 為0.6%;雙氯芬酸鈉99.2%，RSD為0.4%，表明方法的準確性良好。

4.2.2.6 陰性樣品的驗證 取風濕安泰片、風痛安膠囊、豨薟風濕膠囊、風痛片、風濕馬錢片、麝香關(guān)節(jié)止痛膏、骨友靈貼膏、萬通筋骨貼、好百夫康軟膏用薄層方法檢測的陰性供試品。按“3.2.2”項下制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液10 μL 注入液相色譜進行檢測，均未見干擾色譜峰。

4.3 樣品的篩查及確證

4.3.1 采用所建的薄層色譜方法1 對克痹骨泰膠囊、風濕安泰片、風痛安膠囊等樣品進行篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 批樣品克痹骨泰膠囊疑似添加了醋酸潑尼松或醋酸可的松，另1 批陽性樣品清新百合紫蘇膠囊添加了醋酸潑尼松，其他樣品均未發(fā)現(xiàn)添加現(xiàn)象;采用所建的薄層色譜方法2 對上述樣品進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 例添加雙氯芬酸鈉的陽性品種腰間盤突出止痛貼和風濕骨痛貼，其他樣品未發(fā)現(xiàn)添加現(xiàn)象，見圖4。

4.3.2 HPLC 方法確證 對TLC 篩查得到的可疑供試品與陽性供試品采用HPLC 方法進行進一步的確證。

圖4 克痹骨泰膠囊(A)、清新百合紫蘇膠囊(B)、腰間盤突出止痛貼(C)和風濕骨痛貼(D)的薄層色譜圖Fig.4 TLC of Kebi Gutai Capsules (A)、Qinxin Baihe Capsules (B)、Yaojianpan Tuchu Zhitong Plaster(C)and Fengshi Gutong Plaster (D)

可疑供試品 取薄層色譜系統(tǒng)1 篩選出的可疑供試品克痹骨泰膠囊，按高效液相色譜確證方法“3.2.2”項下制備供試品溶液，精密量取供試品溶液10 μL 注入液相色譜進行檢測，其中克痹骨泰膠囊在21 min 與22 min 均出現(xiàn)色譜峰，但通過供試品光譜圖與對照品光譜圖比較，見圖5、圖6，可見克痹骨泰膠囊中的未知峰不是醋酸潑尼松與醋酸可的松［11］。

陽性供試品 將薄層方法初篩得到的陽性品種清新百合膠囊、腰間盤突出止痛貼和風濕骨痛貼按“3.2.2”項下制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液10 μL 注入液相色譜進行檢測，確證了清新百合紫蘇膠囊添加了糖皮質(zhì)激素，其中21 min所得色譜峰的保留時間與對照品光譜圖中醋酸潑尼松相同，光譜特征也一致。同時另外2 個陽性品種的腰間盤突出止痛貼和風濕骨痛貼也添加了雙氯芬酸鈉，其保留時間和光譜特征也一致，見圖6。

薄層色譜系統(tǒng)檢出的3 個陽性樣品，經(jīng)HPLC法進行確證和定量測定，結(jié)果為:清新百合紫蘇膠囊中添加了醋酸潑尼松，含有量約為0.6 mg/粒;腰間盤突出止痛貼中添加了雙氯芬酸鈉，含有量約為3.5 mg/貼;風濕骨痛貼中添加了雙氯芬酸鈉，含有量約為2.5 mg/貼。

圖5 醋酸潑尼松、醋酸可的松、雙氯芬酸鈉的色譜圖(A)和光譜圖(B)Fig.5 Chromatograms (A)and spectrogram (B)of reference substances of Prednisone acctate，Crotisone acetate，Diclofenac sodium

圖6 樣品的色譜圖和光譜圖Fig.6 Chromatograms and spectrogram of samples

4.4 結(jié)論 采用薄層色譜法和HPLC 法結(jié)合的方式，能夠快速、準確地篩查出止痛止癢類中成藥制劑中非法添加的8 種常見抗炎化學藥物(醋酸潑尼松、醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、醋酸可的松、倍他米松、潑尼松、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛)的品種和量。該方法準確，靈敏，適用于不同檢驗機構(gòu)操作，特別是對基層藥監(jiān)部門快速打擊假劣藥品方面發(fā)揮重要作用。

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