響應面優(yōu)化柚皮苷制備根皮乙酰苯-4' -新橘皮糖苷工藝

劉燕青 ，程 凱，王嚴飛，劉 松，單 燕，余 勃，陸 豫*

1南昌大學藥學院，南昌 330006;2 南昌大學中德聯(lián)合研究院，南昌 330047

柚皮苷屬于天然黃酮類化合物［1］，主要存在于蕓香科植物柚的未成熟果實，它是工業(yè)化合成新橙皮苷二氫查爾酮(NHDC)的原料，研究表明NHDC具有強烈的甜味，口感清爽，余味持久，具有極強屏蔽苦味的功效，與其他甜味劑相比具有:甜度高、熱量低、甜味慢、時間長、穩(wěn)定性好、無毒性。對于當今越來越重視健康的社會群體，具有相當大的前景［2-5］。

1973 年Robertson 及其合作者報道了以柚皮苷為原料，大批量生產(chǎn)NHDC，其分三步進行操作:第一步制備根皮乙酰苯-4'-β-新橘皮糖苷(PN);第二步制備新橙皮苷;第三步制備NHDC［7］。在此過程中PN 是個關鍵的中間體。研究者在第一步做了大量的研究，但是產(chǎn)率只有34%［8］，關于第一步國內(nèi)少有研究且還未有報道具體產(chǎn)率。本文采用了響應面試驗設計，對水解柚皮苷制備PN 的工藝進行優(yōu)化［9］，以提高PN 的產(chǎn)率。

1 儀器與材料

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);LC-15C 型高效液相(島津)。

柚皮苷(西安鼎立生物工程有限公司提供，含量90%以上);PN 標準品自制(見“2.1”項);水、氫氧化鉀、鹽酸均為分析純。

2 實驗方法

2.1 PN 標準品的制備

三口瓶中加入KOH 溶液和柚皮苷，待柚皮苷完全溶解后，加熱反應。反應一段時間停止反應，加入等體積水稀釋，冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)pH=6.0 ±0.5，加熱至75 ℃以上使沉淀溶解，置室溫冷卻結晶，減壓抽濾，真空干燥，得粗品PN。取粗品用pH=6.0 ±0.5 的水加熱至75 ℃以上溶解后至室溫冷卻結晶，抽濾;重復上述方法三次干燥得PN 標準品。

2.2 PN 色譜分析條件

色譜柱:Alltech Alltima Silica(4.6 mm × 250 mm，5 μm);流動相∶乙腈∶水=15 ∶85;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;檢測波長:210 nm;進樣量:20 μL。

2.3 PN 標準曲線制作

精確稱取40 mg“2.1”項下制備所得PN 標準品于50 mL 容量瓶中，用適量的甲醇溶解后定容，搖勻，得0.8 mg/mL 的PN 標準溶液。取前一配好的PN 于另一50 mL 容量瓶中稀釋至刻度，搖勻，以此類推，分別配得0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mg/mL PN標準品溶液。以PN 標準品濃度和HPLC 峰面積為縱坐標，得PN 標準曲線。

2.4 PN 產(chǎn)率計算

通過HPLC 檢測，應用PN 標準曲線方程計算其含量，并用公式:產(chǎn)率(%)=實測PN 含量/PN 理論值×100%，計算各反應所得PN 產(chǎn)率。

2.5 PN 制備單因素實驗

以KOH 為催化劑，選用了對產(chǎn)率有顯著影響的五個因素，即水醇比、時間、堿濃度、溫度、料液比，按照實驗步驟以及產(chǎn)率計算方法，計算PN 產(chǎn)率。

2.6 響應曲面法優(yōu)化

采用Box-Behnken 模型，以時間、堿濃度、溫度、液料比、水醇比(V水/V乙醇)為主要的考察因子(自變量)，分別以X1、X2、X3、X4、X5表示，并以+1、0、-1 分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-X0)/ΔX 對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為試驗中心點處自變量真實值，ΔX 為自變量的變化步長，因子編碼及水平見表1。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of response surface methodology

3 結果與分析

3.1 標準品PN 標準曲線方程及表征

HPLC 測按面積歸一化法計算自制PN 標準品含量達 97.73%。制得標準曲線方程:y=0.030895x+0.923992，R2=0.9921。

圖1 自制PN 標準品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of internal prepared PN standard

PN:黃白色固體，mp.156～165 °C;1H NMR(DMSO，600 MHz)δ:12.36(s，1H)，6.03(s，2H)，5.34(s，1H)，5.14(s，1H)，5.09(s，1H)，5.03 (d，J=7.2 Hz，1H)，4.68(s，2H)，4.51(s，2H)，3.69(m，3H)，3.43(m，6H)，3.35(m，2H)，3.22(m，2H)，2.59(s，1H)，1.15(d，J=7.8 Hz，3H);ESI-MS m/z(%):475.8(［M+H］-，50)。

3.2 單因素實驗

3.2.1 水醇比對PN 產(chǎn)率的影響

固定時間為1.75 h，堿濃度為12.25%，溫度為100 ℃，液料比為11.5∶1，考察溶劑對PN 產(chǎn)率的影響。從圖2 可以看出，水醇比對PN 產(chǎn)率有顯著的影響，水作為溶劑時達到最大值。

圖2 水醇比對PN 產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of Water-alcohol ratio on PN yield

3.2.2 時間對PN 產(chǎn)率的影響

固定水醇比為1∶1，堿濃度為12.25%，溫度為100 ℃，液料比為11.5∶1，考察時間對PN 產(chǎn)率的影響。從圖3 可以看出，隨著反應時間的延長產(chǎn)率提高比較顯著，1.75 達到最大值。

圖3 時間對PN 產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of the reaction time on PN yield

3.2.3 堿濃度對PN 產(chǎn)率的影響

固定水醇比為1∶1，時間為1.75 h，溫度為100℃，液料比為11.5∶1，考察時間對PN 產(chǎn)率的影響。從圖4 可以看出反應體系堿濃度增大，PN 的產(chǎn)率相應提高，當堿濃度為12.25%時達到最大值，隨著堿濃度升高開始破壞PN 結構。

3.2.4 溫度對PN 產(chǎn)率的影響

固定水醇比為1∶1，時間為1.75 h，堿濃度為12.25%，液料比為11.5∶1，考察溫度對PN 產(chǎn)率的影響。從圖5 可以看出，隨著溫度升高產(chǎn)率相應提高，當反應溫度達到100 ℃時最大。

圖4 堿濃度對PN 產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of the concentration of potassium hydroxide on PN yield

圖5 溫度對PN 產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of temperature on PN yield

3.2.5 料液比對PN 產(chǎn)率的影響

固定水醇比為1∶1，時間為1.75 h，溫度為100℃，堿濃度為12.25%，考察溫度對PN 產(chǎn)率的影響。從圖6 可以看出，溶劑的量對PN 產(chǎn)率具有顯著影響，當液料比在11.5∶1 時產(chǎn)率達到最大。

圖6 液料比PN 產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on PN yield

3.3 模型建立

表2 列出PN 產(chǎn)率的實測值及其預測值。

表2 實驗設計及其結果Table 2 Experimental designs and results

實驗號1～40 是析因試驗，實驗號41～46 是中心實驗。零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復六次，用以估計試驗誤差。利用Design Expert 軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得PN 產(chǎn)率對自變量之間的多元回歸模型方程為方程(1)。

3.4 方差分析

該模型方差分析結果如表3 所示。

3.5 顯著性檢驗

該模型系數(shù)顯著性檢驗結果如表4 所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 4 Test of significance for regression coefficient

采用軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析，回歸分析見表3、4。當:“Prob ＞F”值小于0.05 時，既表示該項指標顯著，表3 結果表明，對PN 產(chǎn)率所建立的回歸模型是顯著的(P ＜0.0001)，并且該模型的相關系數(shù)R=0.9898，校正決定系數(shù)AdjR2=0.9816 說明，此模型與實際試驗擬合度較好，試驗失擬項小，因此可用該回歸方程代替真實點對實驗結果進行分析。

3.6 PN 產(chǎn)率的響應面分析與優(yōu)化

根據(jù)模型方程(1)所作的響應面圖及其等高線圖見圖7(A～D)。通過該組動態(tài)圖可評價實驗因素對PN 產(chǎn)率的兩兩交互作用，以及確定各個因素的最佳水平范圍。

圖7 Y=f(x1，x2)(A)、Y=f(x2，x5)(B)、Y=f(x2，x3)(C)及Y=f(x3，x5)(D)的響應面Fig.7 Response surface plots of Y=f(x1，x2)(A)，Y=f(x2，x5)(B)，Y=f(x2，x3)(C)and Y=f(x3，x5)(D)

圖7(A)顯示了溫度、液料比、水醇比位于中心點，即80.00、11.50、0.50 時，時間和堿濃度對PN 產(chǎn)率實測值的交互影響效應，等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［10］。由圖可以看出隨著反應時間的延長，堿濃度的增大，PN 產(chǎn)率也隨之升高。時間延長到2.00 h 產(chǎn)率達到最大，隨后產(chǎn)率下降，說明隨著2.00 h 之后產(chǎn)物開始被堿破壞，堿濃度在15%時達到最大，隨后對產(chǎn)物的破壞加大，所以最佳反應時間是2.00 h，堿濃度為15%。

圖7(B)顯示了時間、溫度、液料比位于中心點，即1.75、80.00、11.50 時，堿濃度和水醇比對PN 產(chǎn)率實測值的交互影響效應，由圖可以看出隨著堿濃度和水醇比的升高PN 產(chǎn)率也隨之升高。堿濃度在15.00%時產(chǎn)率、純水作為溶劑時產(chǎn)率最高。

圖7(C)顯示了時間、液料比、水醇比位于中心點，即1.75、11.50、0.50 時，堿濃度和溫度對PN 產(chǎn)率實測值的交互影響效應，由圖可以看出隨著堿濃度和溫度的升高PN 產(chǎn)率也隨之升高。常壓條件下反應溫度在100 ℃時產(chǎn)率最高;堿濃度在15.00%時產(chǎn)率最高，所以最佳反應溫度為100 ℃，堿濃度為15.00%。

圖7(D)顯示了時間、堿濃度、液料比位于中心點，即1.75、12.25、11.50 時，溫度和水醇比對PN 產(chǎn)率實測值的交互影響效應，由圖可以看出用水作溶劑最佳，溫度在100 ℃時產(chǎn)率最高。

利用Design expert 軟件，對方程(1)進行分析，求得PN 產(chǎn)率的最大預測值為69.76%，各主要因素的最佳反應條件為水作為溶劑，反應時間為2 h，堿濃度為15%(w/w)，溫度為100 ℃，料液比為15(v/w)。對上述方程的合適性和有效性進行驗證，開展了10 組驗證實驗，通過驗證實驗得到PN 產(chǎn)率的實測值和預測值相似。證明模型是合理有效的，具有一定的實踐指導意義。

4 結論

本研究利用實驗設計軟件Design expert，首次通過響應面法建立了柚皮苷合成PN 的二次多項數(shù)學模型，經(jīng)驗證為合理有效的，同時對關鍵因子及其相互作用進行研究，確定出柚皮苷合成PN 最佳工藝條件為:水作為溶劑，反應時間為2 h，堿濃度為15%(w/w)，溫度為100 ℃，料液比為15(v/w)。

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