C11orf17蛋白的原核表達(dá)及功能預(yù)測

汪宗桂，左長清，劉振杰，劉新光,3(.廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 東莞 53808；.廣東醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室；3.廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所；4.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科)

C11orf17，又名AKIP1、BCA3，定位于染色體11p15.3，含210個(gè)氨基酸殘基，主要存在于細(xì)胞核中。其最先報(bào)道為乳腺癌相關(guān)蛋白3，即BCA3(breast cancer associated protein 3)，高表達(dá)于前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞系中[1]，但其功能研究目前尚未明確。本實(shí)驗(yàn)室利用酵母雙雜交方法從人骨骼肌細(xì)胞cDNA文庫中篩選了21個(gè)與衰老相關(guān)蛋白prelamin A結(jié)合的陽性候選克隆，其中C11orf17在其C末端98aa的區(qū)域內(nèi)與prelamin A的C末端相結(jié)合(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。為了進(jìn)一步研究其功能，本研究對C11orf17基因編碼區(qū)進(jìn)行克隆、表達(dá)，為研究C11orf17蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，我們采用整合蛋白互作與全基因組共表達(dá)譜生物信息學(xué)方法對其功能進(jìn)行了預(yù)測，為下一步實(shí)驗(yàn)提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α菌種、BL21(DE3)菌種、K562細(xì)胞、pET-32a質(zhì)粒，均由本室保存； 引物、DNA純化試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Pyrobest DNA polymer-ase、內(nèi)切酶BamH I及XhoⅠ為TaKaRa公司產(chǎn)品；Anti-His抗體，購自Santa cruz公司；ECL試劑盒，購自北京中杉金橋公司；BugBuster蛋白抽提試劑購自Novagen公司等。

1.2 方法

1.2.1 K562細(xì)胞總RNA的提取及cDNA的制備 按Trizol試劑盒操作說明提取RNA，取2 μL用DEPC處理水稀釋至500μL，用紫外分光光度法測定A260和A280，RNA濃度(μg/mL)=A260×40×稀釋倍數(shù)；純度以A260/A280比值表示，達(dá)1.8～2.0方能用于實(shí)驗(yàn)。用DEPC處理的去離子水稀釋RNA到終濃度為100 pg/μL，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。RT-PCR結(jié)束后，得到的為cDNA，樣品保存于-20 ℃。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已知的pET32a載體序列以及C11orf17的cDNA編碼序列，運(yùn)用oligo6.0設(shè)計(jì)引物上游引物為：5′ GA GGA TCC ATG GAC AAC TGT TTG GCG GC 3′，含人C11orf17 cDNA編碼區(qū)起始20個(gè)核苷酸，其5′端含BamH I酶切位點(diǎn)；下游引物為：5′ CA CTC GAG CAC AGG GAA GAC CAG GTC CA 3′，與人C11orf17 cDNA編碼區(qū)最后20個(gè)核苷酸互補(bǔ)，其5′ 端含XhoI 酶切位點(diǎn)，引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2.3 pET32a-C11orf17載體的構(gòu)建與鑒定 以制備的cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性5min； 94 ℃30 s，58.2 ℃30 s,72 ℃45 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min,擴(kuò)增完畢后4 ℃終止反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物與pET-32a載體分別進(jìn)行BamH I/XhoⅠ雙酶切，經(jīng)DNA純化試劑盒純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)初步的雙酶切鑒定后，送上海生工公司測序。

1.2.4 融合蛋白C11orf17-His6的原核表達(dá) 將經(jīng)DNA測序驗(yàn)證的pET32a-C11orf17質(zhì)粒及空載體pET-32a分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達(dá)菌BL21(DE3)，鋪入含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂平板上倒置培養(yǎng)，當(dāng)A595值達(dá)1時(shí)，加IPTG至終濃度為0.4 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)立不加IPTG的陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每管取1.5 mL菌液分裝，10 000×g離心1 min，菌體用100 μL滅菌去離子水重懸菌體后，加入等體積的2×蛋白電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min。冷卻后吸取10 μL樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE分析，Western blotting分析所用的樣品則需要稀釋10倍。

1.2.5 融合蛋白C11orf17-His6的可溶性分析 取上述誘導(dǎo)表達(dá)的1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液離心收集的菌體，用300 μL BugBuster試劑重懸沉淀，加入溶菌酶使終濃度為1 KU/mL[溶菌酶可用溶菌酶稀釋液進(jìn)行稀釋：50 mmol/L Tirs-HCl(pH7.5)，100 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.1%Triton X-100]和0.3 μL Benzonase核酸酶以降解核酸，降低抽提物粘度。細(xì)菌重懸后，在水平搖床低速搖動(dòng)，室溫孵育10～20 min。使用Benzonase核酸酶孵育后，細(xì)菌抽提物不應(yīng)為粘稠狀態(tài)。12 000 r/min，4 ℃離心20 min，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，沉淀部分加80～100 μL蒸餾水重懸。分別取10 μL上述處理的上清液和沉淀重懸液，加等體積的2×蛋白電泳上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min，再進(jìn)行SDS-PAGE 和Western blotting分析。

1.2.6 生物信息學(xué)功能預(yù)測 C11orf17的全基因組共表達(dá)分析采用全基因組共表達(dá)資源庫分析web工具UGET(http://genome.ucla.edu/～jdong/GeneCorr.html)進(jìn)行[2]：分析采用芯片平臺為affymetrix公司的HG-U133 Plus 2，選擇與C11orf17基因共表達(dá)強(qiáng)度最高的300個(gè)探針進(jìn)行分析。C11orf17基因的蛋白互作分析：整合人類蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫BioGRID(http:// thebiogrid.org/)[3]和HPRD(www.hprd.org/)[4]相關(guān)資源，搜索與C11orf17蛋白相互作用的已知蛋白。最后采用在線生物信息軟件Gather (http://gather.genome.duke.edu/)分析共表達(dá)基因和相互作用蛋白所富集的生物學(xué)功能。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因的獲得及pET32a-C11orf17載體的構(gòu)建

以K562細(xì)胞總RNA制備的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，取1 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(見圖1的A和B泳道)顯示在500～750 bp之間有很亮的條帶，與理論值630 bp相符，表明PCR擴(kuò)增獲得大量的C11orf17目的片段。將PCR產(chǎn)物連接pET-32a載體后，擴(kuò)增陽性菌落，提取質(zhì)粒分別進(jìn)行BamH I和XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果顯示(見圖1的C泳道)，在約630 bp處及6 000 bp處出現(xiàn)兩條帶，其大小與理論值(目的片段約630 bp，空載體約5 900 bp)相一致，表明C11orf17的PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后已經(jīng)連接到載體pET32a上。將重組子送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其序列與GenBank完全一致，證明原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET32a-C11orf17構(gòu)建成功。

圖1 C11orf17的PCR擴(kuò)增及pET32a-C11orf17載體的雙酶切鑒定

2.2 重組C11orf17-His6融合蛋白的表達(dá)情況及檢測

將重組質(zhì)粒pET32a-C11orf17和空載體pET-32a分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在分子量43.5kD(見圖2的D泳道)和20.4kD(見圖2的B泳道)處分別出現(xiàn)明顯條帶。這與His標(biāo)簽蛋白分子量為20.4kD和C11orf17為23.1kD的理論值相符，即C11orf17-His6融合蛋白分子量為43.5 kD。而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(含pET32a-C11orf17)和BL21(含pET-32a)則未見高表達(dá)量目的條帶，分別見圖2的C泳道和A泳道。為進(jìn)一步確認(rèn)融合蛋白C11orf17-His6得到表達(dá)，本文用anti-His標(biāo)簽抗體對細(xì)菌總裂解液進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果見圖3的E。以上表明重組質(zhì)粒pET32a-C11orf17在大腸桿菌BL21中得到表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)化菌中C11orf17-His6融合蛋白的表達(dá)和Western blotting檢測

2.3 重組C11orf17-His6融合蛋白的可溶性分析及檢測

BugBuster裂解液裂解經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21(含pET32a-C11orf17)菌體，將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上清中未出現(xiàn)大量明顯的重組融合蛋白(見圖3的B泳道)，而在沉淀中43.5kD處發(fā)現(xiàn)大量重組蛋白(見圖3的C泳道)，表明C11orf17-His6主要以不可溶的包涵體形式存在。圖3的A泳道是pET32a-C11orf17重組菌的全蛋白。為進(jìn)一步確認(rèn)C11orf17-His6在沉淀中是否確實(shí)存在，用His標(biāo)簽抗體Western blotting進(jìn)一步檢測融合蛋白的表達(dá)情況(圖3的D泳道)。結(jié)果顯示C11orf17-His6融合蛋白在DE3的包涵體中成功表達(dá)。

圖3 C11orf17-His6融合蛋白的可溶性分析和Western blotting檢測

2.4 生物信息學(xué)功能預(yù)測

UGET分析得到前300個(gè)共表達(dá)基因探針中，包含267個(gè)已知基因(gene symbol)。在線Gather軟件對267個(gè)共表達(dá)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：共表達(dá)基因主要富集基因分子功能本體GO:0007154(cell communication)，GO:0007165(signal transduction)，GO:0007049(cell cycle) (P<0.000 1)。整合人類蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫BioGRID和HPRD資源分析發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)研究證明的C11orf17相互作用蛋白只有PRKACA (protein kinase,cAMP-dependent,catalytic,alpha)蛋白，后者是細(xì)胞周期數(shù)據(jù)庫(Cell Cycle Database：http://www.itb.cnr.it/cellcycle/index.html )的重要成員。

3 討 論

中國社會正面臨嚴(yán)重的人口老齡化問題，有關(guān)衰老和老齡化的研究顯得十分緊迫而必須。由于人類的生命周期較長，正常的衰老過程不易研究，因此衰老的研究通常利用人類早衰的病人來完成，進(jìn)而揭示正常衰老過程的分子機(jī)理。兒童早老癥(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome,HGPS)是一種非常罕見的遺傳疾病，患者出生時(shí)正常，但會以每年衰老10歲的速度老化，平均壽命為13歲，90%以上因?yàn)檫M(jìn)行性冠狀動(dòng)脈和腦血管硬化死亡[5]。HGPS是由于LMNA基因在其外顯子11的1824位發(fā)生核苷酸替代(C→T)，盡管未造成氨基酸殘基的改變(G608G)，但產(chǎn)生了一個(gè)潛在的剪切位點(diǎn)，導(dǎo)致外顯子11的150nt被剪切，使得A型核纖層蛋白前體(prelamin A，PLA)的C末端50個(gè)氨基酸殘基被切除[6]，阻止了后續(xù)的蛋白水解使之加工為成熟的lamin A的過程。這表明prelamin A的加工和成熟過程與細(xì)胞衰老緊密相關(guān)。而prelamin A可能通過與其他蛋白相互作用最終引起細(xì)胞的早衰，尋找新的與細(xì)胞衰老相關(guān)的prelamin A結(jié)合蛋白并對其生物學(xué)功能進(jìn)行研究，對于探索細(xì)胞衰老發(fā)生的機(jī)制具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)C11orf17在其C末端98aa的區(qū)域內(nèi)與prelamin A的C末端相結(jié)合。此區(qū)域包含了SH2結(jié)合序列、PKC磷酸化模體及CK2磷酸化位點(diǎn)，并且C11orf17的羧基端即-F-P-V序列高度保守，對應(yīng)于共同的結(jié)合序列為-F/Y-x-(A/F/V)，此序列來源于II型PDZ結(jié)構(gòu)域包含蛋白，PDZ功能域蛋白主要定位在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)，它們能結(jié)合底物的羧基端，包含有另外的激酶功能域[1]。這暗示著C11orf17的C末端區(qū)域具有許多未知的重要功能需要我們?nèi)ヌ接憽?/p>

本文以K562細(xì)胞的cDNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，成功構(gòu)建C11orf17的原核表達(dá)載體，測序驗(yàn)證其序列于GenBank中序列完全一致，并且，經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了高表達(dá)量的融合蛋白，用His標(biāo)簽抗體Western blotting檢測顯示，C11orf17-His6融合蛋白在大腸桿菌DE3的包涵體中成功表達(dá)。這為抗體制備提供了足夠的抗原，對進(jìn)一步研究C11orf17蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有十分重要的意義。

關(guān)于新基因、蛋白功能預(yù)測，目前廣泛使用的方法為利用高通量的基因表達(dá)[7]和蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)[8-9]進(jìn)行分析。通過整合兩種方法有利于預(yù)測結(jié)果的可靠性。本研究對C11orf17進(jìn)行了全基因組共表達(dá)基因分析，結(jié)果表明：共表達(dá)基因富集細(xì)胞交流，信號傳導(dǎo)，細(xì)胞周期等功能，提示C11orf17可能具有以上相關(guān)功能。進(jìn)一步分析已知的相互作用蛋白發(fā)現(xiàn)：C11orf17能與PRKACA蛋白相互作用。PRKACA是cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基，研究證明其與細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期功能密切相關(guān)[10]，是細(xì)胞周期數(shù)據(jù)庫的重要成員。通過整合共表達(dá)基因和蛋白相互作用預(yù)測結(jié)果，我們認(rèn)為：C11orf17可能是細(xì)胞周期調(diào)控的重要新分子。衰老相關(guān)prelamin A蛋白對細(xì)胞衰老過程中的細(xì)胞周期調(diào)控是否與其新的相互作用蛋白C11orf17相關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

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