烏司他丁對幼豬深低溫低流量體外循環(huán)心臟手術(shù)腎損傷的影響

王曉湊，薛慶華，晏馥霞，李立環(huán)，劉晉萍，李守軍，胡盛壽

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院 麻醉科，北京 100037；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院 體外循環(huán)科，北京 100037；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院 心臟外科，北京100037）

新生兒和嬰幼兒先天性心臟病體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）心臟手術(shù)可引起腎損傷，據(jù)Kwiatkowski等[1]報道，該類手術(shù)急性腎損傷發(fā)生率高達(dá)6%～28%。CPB后急性腎損傷的機(jī)制尚未完全闡明，目前研究[2]認(rèn)為炎癥反應(yīng)所觸發(fā)的腎血管內(nèi)皮損傷，及其引起的腎血管通透性增加和組織灌注不足為其主要機(jī)制。本研究旨在通過幼豬深低溫低流量CPB心臟手術(shù)期間應(yīng)用廣譜蛋白酶抑制劑烏司他丁，探討其對腎損傷作用的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 北京長白幼豬15例（北京懷革養(yǎng)殖場提供），采用隨機(jī)數(shù)表法分為烏司他丁組（U組，n=5）、對照組（C組，n=5）和假手術(shù)組（S組，n=5）。雌雄不計，日齡（18±3）d，術(shù)前禁配方乳6 h，禁水4 h。實驗方案經(jīng)阜外心血管病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后實施。

1.2 麻醉方法 為降低動物圍術(shù)期的病死率，本研究采用模擬臨床小兒心臟手術(shù)的麻醉管理方法[3]，簡述如下。實驗動物肌注氯胺酮10 mg·kg-1、咪唑安定0.5 mg·kg-1、阿托品0.05 mg·kg-1，待動物安靜后連接心電監(jiān)護(hù)并開放靜脈。麻醉誘導(dǎo)用哌庫溴銨1.5 mg·kg-1、咪唑安定0.25 mg·kg-1、芬太尼20μg·kg-1靜脈注射。誘導(dǎo)時用自制簡易呼吸面罩手控球囊控制通氣。氣管插管后接麻醉機(jī)（Drager Primus，Drager公司，德國），給予機(jī)械通氣，吸入1.0%～1.5%七氟烷。中心靜脈、頸內(nèi)動脈切開置管，接壓力感受器。U組和C組分別在切皮前、CPB前、復(fù)溫開始后、CPB停機(jī)后給予哌庫溴銨0.5 mg·kg-1、咪唑安定0.2 mg·kg-1、芬太尼100μg·kg-1靜脈注射。術(shù)中根據(jù)監(jiān)測指標(biāo)和血氣分析維持循環(huán)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。維持動脈血酸堿度7.35～7.45，氧分壓80～120 mmHg，二氧化碳分壓35～45 mmHg，氧飽和度95%～100%，剩余堿±2.3 mmol·L-1，血紅蛋白＞8.5 g·dL-1，鈉離子135～145 mmol·L-1，鉀離子3.5～4.5 mmol·L-1。

1.3 心臟手術(shù)與CPB U組和C組實驗動物麻醉后仰臥位正中開胸，主動脈、右心耳插管后開始并行循環(huán)，鼻咽溫降至34 ℃，阻斷主動脈，主動脈根部灌注Thomas心肌停跳液10～15 mL·kg-1，間隔30 min加灌一次，心臟停跳，逐漸降溫。體溫降至25 ℃時，開始低流量（50 mL·kg-1·min-1）循環(huán)，主動脈阻斷120 min后復(fù)溫，體溫升至30 ℃開放主動脈。全流量循環(huán)輔助30 min左右，鼻咽溫升至35～36 ℃時調(diào)整停機(jī)。CPB前給予全量肝素300～400 IU·kg-1，激活全血凝血時間＞500 s，停機(jī)后給予等量魚精蛋白。觀察2 h后取右腎上極腎組織。為觀察確切的腎保護(hù)作用，采用2倍于臨床劑量（1.2萬IU·kg-1）的烏司他丁，即U組在CPB開始和循環(huán)開放即刻分別在CPB管道中給予烏司他?。ㄉa(chǎn)批號：H19990134，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）1.2萬IU·kg-1，C組給予等量0.9%氯化鈉溶液。S組實驗動物麻醉后開胸，即取右腎上極腎組織。實驗結(jié)束，所有動物靜脈注射5%氯化鉀5 mL處死。

1.4 檢測指標(biāo)和方法 實驗動物在麻醉誘導(dǎo)后即刻（T1）、U組和C組在停機(jī)后5 min（T2）、120 min（T3）取靜脈血，于5 ℃ 3 000 r/min離心15 min離取血清置于-80 ℃冰箱凍存。檢測指標(biāo)：①胱抑素C（CysC）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析試劑盒均購于美國R&D公司，血清解凍后按說明書采用ELISA法檢測上述指標(biāo)。②血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）采用全自動生化分析儀（貝克曼DXC800，美國）檢測。所有動物在實驗結(jié)束時，用注射器抽取膀胱中尿液2 mL，-80 ℃凍存，解凍后采用顆粒增強散射免疫比濁法測N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG），試劑由美國Behring公司提供；取右腎上極，用10%甲醛固定48 h后行石蠟包埋，切片后HE染色，結(jié)果于光學(xué)顯微鏡下觀察，采用半定量分析方法進(jìn)行腎損傷評分[4]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用 ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 所有動物均完成至實驗結(jié)束，幼豬體質(zhì)量（4.8±1.7）kg，麻醉誘導(dǎo)時間為（6±2）min后開始安靜，U組CPB轉(zhuǎn)機(jī)（189±11）min，C組CPB轉(zhuǎn)機(jī)（183±12）min（P＞0.05）；U組主動脈阻斷（128±10）min，C組主動脈阻斷（136±13）min（P＞0.05）；U組麻醉維持時間（342±18）min，C組麻醉維持時間（339±21）min（P＞0.05）。

2.2 血清CysC、SCr、BUN、IL-6和TNF-α檢測結(jié)果 三組動物在T1時點的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。在各自相同時點，U組和C組的上述檢測指標(biāo)對比如下：在T2時點，U組的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比C組分別降低12.50%（P＞0.05）、2.97%（P＞0.05）、0.37%（P＞0.05）、26.28%（P＜0.05）、10.81%（P＜0.05）；在T3時點，U組的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比C組分別降低24.37%（P＜0.05）、17.20%（P＜0.05）、16.82%（P＜0.05）、18.12%（P＜0.05）、8.57%（P＞0.05）。就C組而言，T2時點的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1時點分別升高23.61%（P＜0.05）、22.78%（P＜0.05）、28.07%（P＜0.05）、44.21%（P＜0.05）、12.12%（P＜0.05），T3時點的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1時點分別升高64.79%（P＜0.05）、65.56%（P＜0.05）、73.82%（P＜0.05）、45.26%（P＜0.05）、6.06%（P＞0.05）。就U組而言，T2時點的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1時點分別升高13.79%（P＞0.05）、19.11%（P＞0.05）、19.16%（P＜0.05）、7.45%（P＞0.05）、6.45%（P＞0.05），T3時點的CysC、SCr、BUN、IL-6、TNF-α比T1時點分別升高31.11%（P＜0.05）、37.05%（P＜0.05）、35.02%（P＜0.05）、20.21%（P＜0.05）、3.22%（P＞0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 血清CysC、SCr、BUN、IL-6和TNF-α檢測結(jié)果（n=5， ±s）

2.3 病理和尿NAG檢測結(jié)果 U組和C組均見腎損傷表現(xiàn)。與U組比較，C組腎組織HE染色10×40鏡下觀察可見腎小管呈不同程度水腫， 部分伴間質(zhì)水腫和/或少量炎性細(xì)胞浸潤，部分可見小管細(xì)胞空泡變性，腎小球未見明顯病理改變；S組為正常腎組織，見圖1。半定量評分結(jié)果顯示：C組（5.4±0.07）高于U組（3.8±0.3）（P＜0.05）。U組尿NAG結(jié)果為（13.30±2.23）U·L-1，C組為（27.24±4.53）U·L-1，與C組相比，U組尿NAG降低了51.17%（P＜0.05）。

3 討論

圖1 腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果（HE，×400）

急性腎損傷仍是CPB心臟手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，當(dāng)腎損傷患者病程發(fā)展到需要連續(xù)腎臟替代療法治療時，病死率高達(dá)68%，而生還者大多數(shù)需要長期依賴透析治療，可見腎損傷嚴(yán)重影響心臟手術(shù)療效[5]。由于腎組織代償調(diào)節(jié)功能的不成熟，新生兒和嬰幼兒CPB心臟手術(shù)更易并發(fā)急性腎損傷。為模擬小兒腎臟組織，本研究采用相當(dāng)于人類月齡7～10個月的低齡幼豬。C組在CPB停機(jī)后5 min、120 min的腎損傷指標(biāo)CysC、SCr、BUN均高于麻醉誘導(dǎo)后即刻，尿NAG高于S組，腎組織病理檢查可見損傷改變，提示，深低溫低流量CPB心臟手術(shù)對低齡生物存在腎損傷作用，這與多數(shù)同類研究[6-8]結(jié)果相一致。

炎癥反應(yīng)是CPB腎損傷的主要觸發(fā)因素[9-12]。CPB期間，血液與人工心肺機(jī)的異物表面相接觸、手術(shù)創(chuàng)傷、器官的缺血-再灌注等可誘發(fā)單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的聚集和活化，進(jìn)而釋放炎癥因子。炎癥因子和炎癥細(xì)胞又可發(fā)生聯(lián)級、放大效應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征最終導(dǎo)致腎小管破壞[10]。此外，血紅細(xì)胞破外釋放的游離血紅蛋白致使腎小管阻塞而導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞壞死，更加劇了腎損傷[11]。血清IL-6和TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)記物之一，可在早期出現(xiàn)升高。本研究結(jié)果也證實，與麻醉誘導(dǎo)后即刻相比，C組在CPB停機(jī)后5 min、120 min的血清IL-6和TNF-α均出現(xiàn)升高。因此，如何減輕CPB期間的炎癥反應(yīng)成為減輕CPB期間腎損傷的重要研究方向。

烏司他丁是一種從健康成年男性尿液中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑，能夠抑制多種蛋白酶的活性和炎性因子的釋放以及穩(wěn)定溶酶體膜防止水解酶的外溢，臨床上主要用于治療急性胰腺炎、急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征、全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙綜合征等。本研究顯示，U組在CPB停機(jī)后5 min、120 min腎損傷指標(biāo)CysC、SCr、BUN低于C組，在實驗終點時尿NAG低于C組；病理學(xué)檢查示U組腎損傷程度輕于C組，腎損傷半定量評分低于C組。提示烏司他丁對幼豬CPB心臟手術(shù)具有腎保護(hù)作用，這與同類研究[13-14]結(jié)果相一致。U組在CPB停機(jī)后5 min、120 min炎癥反應(yīng)指標(biāo)血清IL-6和TNF-α均低于C組，提示烏司他丁通過抑制炎癥因子的釋放減輕炎癥反應(yīng)，從而起到腎保護(hù)作用。此外，Nishiyama等[15]的研究表明，烏司他丁可通過抑制紅細(xì)胞破壞，降低游離血紅蛋白含量，從而減少游離血紅蛋白在腎小管的阻塞，達(dá)到腎保護(hù)作用。

本研究存在如下不足：首先，我們僅對常見的早期炎癥反應(yīng)指標(biāo)IL-6和TNF-α進(jìn)行了檢測，檢測指標(biāo)未包括該類指標(biāo)的上游產(chǎn)物（如相關(guān)的mRNA）和相關(guān)調(diào)控因子（如NF-κB），因此，烏司他丁抑制CPB心臟手術(shù)炎癥反應(yīng)鏈中的目標(biāo)環(huán)節(jié)及其機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究；其次，在數(shù)據(jù)采集點的設(shè)計上，我們僅對麻醉誘導(dǎo)后即刻（作為基準(zhǔn)值），停機(jī)后5 min（反映CPB后檢測指標(biāo)的變化）和停機(jī)后120 min（臨床上急性腎損傷出現(xiàn)率較高的時點）的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行采集，實驗終點即處死實驗動物，未對其遠(yuǎn)期腎功能變化及其存活率進(jìn)行監(jiān)測；再次，我們未對腎血管通透性進(jìn)行研究，CPB引發(fā)的急性炎癥反應(yīng)以及腎缺血-再灌注損傷可引起腎血管通透性增加，烏司他丁是否通過作用于腎血管通透性達(dá)到腎保護(hù)作用，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)深低溫低流量CPB心臟手術(shù)對幼豬存在腎損傷，烏司他丁可通過抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到對抗腎損傷（腎保護(hù)）的作用。

[1] Kwiatkowski DM, Goldstein SL, Krawczeski CD. Biomarkers of acute kidney injury in pediatric cardiac patients[J].Biomark Med, 2012, 6(3): 273-282.

[2] Morgan CJ, Gill PJ, Lam S, et al. Peri-operative interventions, but not infl ammatory mediators, increase risk of acute kidney injury after cardiac surgery: a prospective cohort study[J]. Intensive Care Med, 2013, 39(5): 934-941.

[3] 王曉湊, 薛慶華, 晏馥霞, 等. 小兒體外循環(huán)心臟手術(shù)麻醉管理方法在幼豬中的應(yīng)用評價[J]. 實用兒科臨床雜志,2012, 27(1): 50-52.

[4] Zhu J, Yin R, Shao H, et al. N-acetylcysteine to ameliorate acute renal injury in a rat cardiopulmonary bypass model[J].J Thorac Cardiovasc Surg, 2007, 133(3): 696-703.

[5] Kumar AB, Suneja M, Bayman EO, et al. Association between postoperative acute kidney injury and duration of cardiopulmonary bypass: a meta-analysis[J]. J Cardiothorac Vasc Anesth, 2012, 26(1): 64-69.

[6] Brown JR, Kramer RS, Coca SG, et al. Duration of acute kidney injury impacts long-term survival after cardiac surgery[J]. Ann Thorac Surg, 2010, 90(4): 1142-1148.

[7] Goebel U, Siepe M, Schwer CI, et al. Inhaled carbon monoxide prevents acute kidney injury in pigs after cardiopulmonary bypass by inducing a heat shock response[J].Anesth Analg, 2010, 111(1): 29-37.

[8] Blinder JJ, Goldstein SL, Lee VV, et al. Congenital heart surgery in infants: Effects of acute kidney injury on outcomes[J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2012, 143(2): 368-374.

[9] Wang G, Huang H, Wu H, et al. Erythropoietin attenuates cardiopulmonary bypass-induced renal infl ammatory injury by inhibiting nuclear factor-kappa B P65 expression[J]. Eur J Pharmacol, 2012, 689(1-3): 154-159.

[10] Mariscalco G, Lorusso R, Dominici C, et al. Acute kidney injury: a relevant complication after cardiac surgery[J]. Ann Thorac Surg, 2011, 92(4): 1539-1547.

[11] Moussavian MR, Slotta JE, Kollmar O, et al. Hemoglobin induces cytotoxic damage of glycine-preserved renal tubules[J]. Transpl Int, 2007, 20(10): 884-894.

[12] Kiaii B, Fox S, Swinamer SA, et al. The early infl ammatory response in a mini-cardiopulmonary bypass system: a prospective randomized study[J]. Innovations (Phila), 2012,7(1): 23-32.

[13] Lema G. Ulinastatin treatment and renal injury in patients undergoing aortic valve replacement with cardiopulmonary bypass. A note of aution[J]. Korean J Anesthesiol, 2013,64(1): 91-92.

[14] 李倩, 劉鈺, 劉蘇, 等. 烏司他丁對二尖瓣置換術(shù)患者肺和腎臟的保護(hù)作用[J]. 中華實驗外科雜志, 2012, 29(6): 1184-1186.

[15] Nishiyama T, Hanaoka K. Hemolysis in stored red blood cell concentrates: modulation by haptoglobin or ulinastatin, a protease inhibitor[J]. Crit Care Med, 2001, 29(10): 1979-1982.