香青蘭總黃酮在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究

袁勇，邢建國，王立萍，姚佳茗，王新春，

（1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，石河子 832002；2新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；3石河子大學藥學院,石河子 832002）

香青蘭Dracocephalum moldevica L.為唇形科青蘭屬植物，又名巴迪然吉布亞，味甘、苦，性涼，歸肝、脾經(jīng)，有瀉火、清熱、止血的功能，香青蘭藥理作用廣泛，尤其對冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等心血管疾病具有較好的療效[1-2]。香青蘭主要含有揮發(fā)油、萜類、黃酮類、氨基酸、微量元素等多種化學成分，其中，黃酮類成分是其發(fā)揮藥理作用的主要活性成分[3-4]。目前，香青蘭總黃酮在大鼠體內(nèi)的藥動學研究還未見報道，因此，本研究以主要成分田薊苷為指標，建立了測定大鼠血漿中田薊苷濃度的高效液相色譜方法，測定大鼠灌胃給予香青蘭總黃酮提取物后田薊苷的血藥濃度，研究香青蘭總黃酮在大鼠體內(nèi)的藥代動力學特征，為其合理開發(fā)和應(yīng)用提供藥動學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-10AT高效液相色譜儀（日本島津）；超聲波發(fā)生器（美國科學系統(tǒng)公司）；CT-64電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司)；TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試藥

香青蘭總黃酮提取物 （石河子大學實驗室自制，批號20080310，總黃酮含量為57%）；田薊苷對照品 (新疆自治區(qū)藥物研究所提供，經(jīng)1H NMR、13C NMR 、MS、IR等方法鑒定結(jié)構(gòu)。經(jīng)HPLC測定，純度大于 98%)；PEG400(北京化學試劑公司)；乙腈（天津市福晨化學試劑廠）；水為重蒸水；其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

實驗動物SD大鼠，清潔Ⅱ級，體重（250～280）g，雌雄各半，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：新醫(yī)動字第2003-0001號。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相： 乙腈-0.4%磷酸水 （34∶66）； 色譜柱：AgilentC18（4.6×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：20 μL；檢測波長 327 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品儲備液的配制

精密稱取田薊苷對照品5 mg置于10 mL容量瓶，乙腈定容，作為田薊苷的儲備液。

2.2.2 口服給藥供試液的配制

分別精密稱取香青蘭總黃酮提取物及CMC-Na適量放入研缽中，再加入適量超純水，邊加水邊攪拌至CMC-Na為0.5%，繼續(xù)研磨至香青蘭總黃酮提取物粉末成懸浮狀態(tài)即可。

2.3 血漿樣品的處理[5]

精密吸取血漿樣品200 μL，加入2 mL乙腈，渦旋3 min，然后置離心機中，12000 r/min離心10 min。分離有機層，N2吹干，殘渣用100 μL乙腈復(fù)溶，離心，上樣測定。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性試驗

分別取空白血漿、加田薊苷對照品的空白血漿、給藥后的血漿樣品，按2.3項下方法處理后，在上述色譜條件下各進樣20 μL。色譜圖見圖1，結(jié)果表明，在本試驗條件下，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測定。

圖1 田薊苷血漿樣品的HPLC圖Fig.1 Chromatograms of Tilianin in plasma by HPLC

2.4.2 線性關(guān)系考察

精密吸取田薊苷對照品儲備液適量置于200 μL空白血漿中，按倍數(shù)稀釋法配制田薊苷濃度為0.031，0.124，0.248，1.984，3.968，19.840，39.680 μg/mL的血漿樣品，按2.3項下處理。HPLC分析測定，以血漿中田薊苷濃度對峰面積進行加權(quán)(1/X2)最小二乘法回歸，得血漿中田薊苷的標準曲線為：Y=34317.354X+1772.737，r=0.9990 （n=5）， 線性范圍0.031-39.68 μg/mL，定量限為 0.031 μg/mL。

2.4.3 準確度與精密度

按標準曲線項下方法，分別吸取不同體積的田薊苷對照品溶液加入200 μL空白血漿中，得高、中、低 3 個濃度（39.680，3.968，0.031 μg/mL）的血漿樣品，每個濃度制備5份，按2.3項下血漿樣品處理方法處理后進樣分析，計算本法的回收率和精密度。結(jié)果田薊苷日內(nèi)、日間精密度RSD均＜10%，回收率為98.01%～103.23%,分別見表1和表2。

表1 田薊苷血漿樣品精密度 ±S,n=5Tab.1 The precision of tilianin in plasma

表1 田薊苷血漿樣品精密度 ±S,n=5Tab.1 The precision of tilianin in plasma

血漿濃度（μg/mL） Mean±SD RSD/% Mean±SD RSD/%日內(nèi) 日間39.680 39.247±0.471 1.20 38.902±0.568 1.46 3.968 3.912±0.064 1.64 3.878±0.078 2.01 0.031 0.032±0.001 3.13 0.033±0.002 6.07

表2 田薊苷血漿樣品回收率Tab.2 The recovery of tilianin in plasma ±S,n=5

表2 田薊苷血漿樣品回收率Tab.2 The recovery of tilianin in plasma ±S,n=5

理論濃度/（μg/mL） 測量濃度/（μg/mL） 回收率/%39.680 39.150 38.209 39.457 39.162 38.470 98.01±1.35 3.968 3.957 3.969 3.816 3.877 3.941 98.59±1.64 0.031 0.032 0.033 0.031 0.032 0.032 103.23±2.28

2.4.4 提取回收率試驗

配制高、中、低3個濃度的血漿樣品，按2.3項下血漿樣品處理方法處理后經(jīng)HPLC測定，測得提取回收率在72.67%～90.35%之間，結(jié)果見表3。

表3 田薊苷血漿樣品提取回收率 ±S,n=5Tab.3 The extraction recovery of tilianin in plasma

表3 田薊苷血漿樣品提取回收率 ±S,n=5Tab.3 The extraction recovery of tilianin in plasma

濃度 /（μg/mL）39.680 3.968 0.050 Mean±SD RSD/%90.03±2.83 3.14 90.35±1.96 2.17 72.67±1.53 2.10

2.5 大鼠體內(nèi)藥動學研究

2.5.1 樣本的采集[6-7]

取SD大鼠24只，雌雄各半，隨機分成4組，每組6只，禁食12 h(自由飲水)。前3組以高、中、低3個劑量(1200，600，300 mg/kg)灌胃香青蘭總黃酮提取物，給藥后 0.083，0.167，0.250，0.417，0.750，1，2，3，5，7，9 h 眼眶采血 0.5 mL，離心，分離血漿，-20℃保存待用。大鼠口服給藥后，香青蘭總黃酮中田薊苷的藥動學參數(shù)見表4，藥時曲線見圖2。

表4 大鼠灌胃香青蘭總黃酮提取物后田薊苷的藥代動力學參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of Tilianin after oral administration of TFDM ±S,n=6

表4 大鼠灌胃香青蘭總黃酮提取物后田薊苷的藥代動力學參數(shù)Tab.4 Pharmacokinetic parameters of Tilianin after oral administration of TFDM ±S,n=6

香青蘭總黃酮提取物給藥劑量/（mg/kg）300 600 1200 K/h 1.065±0.383 1.835±1.081 0.560±0.351 Ka/h 8.814±3.793 6.735±2.419 5.505±3.723 t1/2α/h 0.221±0.112 1.218±0.672 0.527±0.173 t1/2β/h 6.904±0.922 6.512±3.302 9.820±3.116參數(shù)V1/F/（L/kg） 854.127±311.053 2353.604±349.273 418.230±99.161 CL/F/（L/（h/kg）） 419.227±27.169 457.394±16.566 192.257±13.702 AUC（0-t）/（mg/（L/h）） 0.527±0.018 0.980±0.097 1.215±0.108 MRT（0-t）/h 3.445±0.089 3.131±0.152 2.450±0.150 T max/h 0.292±0.083 0.139±0.048 0.222±0.048 C max/mg/L 0.177±0.018 0.451±0.064 0.656±0.115

圖2 大鼠灌胃香青蘭總黃酮提取物后田薊苷的藥-時曲線Fig.2 The plasma concentration-time courses of Tilianin after oral administration of TFDM

3 討論

本實驗結(jié)果顯示大鼠灌胃香青蘭總黃酮后田薊苷的藥代動力學過程符合二室模型?？诜蛰^迅速，Tmax為8-22 min，提示其在胃和小腸上部即被吸收。分布相半衰期t1/2α僅在0.218-1.218 h，說明其從中央室向周邊室分布較快。在各給藥劑量下K12均大于相應(yīng)的K21，表明從中央室向周邊室的轉(zhuǎn)運速率大于藥物從周邊室向中央室的速率。

香青蘭總黃酮由低劑量增加至中劑量時，大鼠血漿中田薊苷的AUC（0-t）和Cmax逐漸增加，總消除速率常數(shù)K，清除率CL/F和消除相半衰期t1/2β無顯著性變化，呈線性動力學特征。但當由中劑量增至高劑量時，AUC（0-t）和 Cmax增加較慢，K 和 CL/F 明顯減少，t1/2β顯著延長（P＜0.05），藥動學呈非線性動力學特征。這可能是由于香青蘭總黃酮在體內(nèi)涉及容量限制過程，當給藥劑量及產(chǎn)生的血藥濃度超過一定限度時，體內(nèi)酶的催化能力和載體轉(zhuǎn)運能力達到飽和，藥動學呈現(xiàn)明顯的劑量依賴。前期Caco-2細胞攝取實驗結(jié)果表明田薊苷是Na+依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運載體 1（SGLT1）和 P-糖蛋白（P-gp）的底物，這可能是其藥動學呈非線性特征的重要原因[8]。

實驗中還考察了高、中、低3個濃度的血漿樣品在反復(fù)凍融3次、-20℃冷藏6 d和室溫放置6 h條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果田薊苷在各條件下均無顯著濃度變化，說明樣品在測定條件下是穩(wěn)定的。

[1]曹文疆,王新春,邢建國,等.香青蘭總黃酮對TNF-α誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(21):159-161.

[2]楊彩玉,安希文,付偉,等.香青蘭總黃酮對大鼠離體胸主動脈的舒張作用[J].生物物理學報,2010,26(4):334-340.

[3]楊麗娜,邢建國,何承輝,等.維藥香青蘭的化學成分與藥理作用評價[J].世界臨床藥物,2013,34(4):226-231.

[4]馮長根,李瓊.香青蘭化學成分研究[J].中成藥,2006,28(1):94-98.

[5]覃禹,仇峰,韋日偉,等.中藥多組分藥代動力學的研究進展[J].解放軍藥學學報,2011,27(6):548-552.

[6]王桂紅,劉丹,吳杰,等.霉茶總黃酮在大鼠體內(nèi)的藥代動力學[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(11):2882-2883.

[7]馮亮,蔣學華.三七總皂苷在大鼠體內(nèi)的藥物動力學研究[J].華西藥學雜志,2010,25(1):46-49.

[8]黃志巧,邢建國,王新春,等.田薊苷在Caco-2細胞模型中的吸收特性研究[J].中國中藥雜志,2012,37(9):1315-1318.