畢赤酵母表達(dá)Neuritin蛋白的純化及鑒定

張云華，朱井玲，熊安英，單莉婭，朱美意，鄭艷，郝慧星，黃瑾

（新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室/石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，石河子 832002）

神經(jīng)系統(tǒng)病變和損傷的治療一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題，目前臨床上多用以神經(jīng)營養(yǎng)因子為主的藥物治理。神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、生長和分化的多肽或蛋白質(zhì)，可以為神經(jīng)再生提供良好的微環(huán)境，在防止神經(jīng)細(xì)胞的退變和促進(jìn)神經(jīng)突起的生長等方面起著十分重要的作用[1-3]。因此關(guān)于神經(jīng)營養(yǎng)因子神經(jīng)再生和防止神經(jīng)元退行性變的應(yīng)用研究一直是研究領(lǐng)域中的熱點。Neuritin是一種與神經(jīng)可塑性相關(guān)的營養(yǎng)因子，1993年Nedivi等[4]在谷氨酸類似物紅藻氨酸鹽的誘導(dǎo)下從大鼠海馬齒狀回篩選到CPG15(candidate plasticity-related gene15)。1997年對CPG15研究顯示，CPG15能夠促進(jìn)神經(jīng)突起的快速生長，故將其命名為 Neuritin[5]。

Neuritin在胚胎發(fā)育期可維持神經(jīng)元存活、抑制凋亡[6]，調(diào)節(jié)神經(jīng)祖細(xì)胞分化、移行和突觸成熟[7]；在成年期，能促進(jìn)突起的生長[5]，調(diào)節(jié)突觸回路的形成[8]，還介導(dǎo)了學(xué)習(xí)和記憶的突觸重塑過程，可能是BDNF控制的突觸可塑性和記憶鞏固的效應(yīng)器[9]，另外它是一類新發(fā)現(xiàn)的血管生長因子，并作為潛在的癌癥治療靶點[10]。為獲得大量Neuritin基因工程產(chǎn)物以進(jìn)行生物學(xué)功能的研究，本實驗利用前期構(gòu)建重組GSll5／pPIC9K-Neuritin畢赤酵母工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)重組的Neuritin蛋白并進(jìn)行純化和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株GS115／pPIC9K-Neuritin由本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 儀器與試劑AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)購自GE公司；His-Trap Crud親和層析預(yù)裝柱購自GE公司；電泳儀購自BIO-RAD公司；離心超濾管購自Millipore公司。

酵母提取物和胰蛋白胨購自O(shè)xide公司；酵母氮源（YNB）和 G418均購自 Invitrogen公司；YPD、BMGY和BMMY培養(yǎng)基配方見Invitrogen公司提供的畢赤酵母操作手冊；NC膜購自Whatman公司；His抗體和羊抗鼠IgG-HRP購自Bio-Rad公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購置Pierce公司；透析袋購自spectrum labs公司；蛋白分子量marker購自Thermo公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取GSll5／pPIC9K-Neuritin工程菌的單克隆菌落，在YPD培養(yǎng)基中30℃ 220 r/min培養(yǎng)過夜。按照1∶50接種于1 L BMGY培養(yǎng)基，30℃ 220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約4 h，5000 r/min離心 5 min， 棄上清，收集菌體重懸于1 L BMMY培養(yǎng)液中,加入終濃度為1%的甲醇。30℃ 220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每隔24 h補加甲醇至終濃度為1%。

1.2.2 表達(dá)產(chǎn)物的鹽析離心誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)液14000 r/min 30 min 4℃，收集上清，用終濃度為65%的硫酸銨飽和沉淀，4℃過夜。過夜鹽析后的溶液，14000 r/min 30 min 4℃離心沉淀。

1.2.3 親和層析收集離心沉淀的蛋白，加start buffer溶解，0.22 μm濾器過濾，純化過程參考GE Healthcare親和層析純化手冊。其中start buffer（20 mmol/L sodium phosphate,0.5 mol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH 7.4），elution buffer （20 mmol/L sodium phosphate,0.5mol/L NaCl,300 mmol/L imidazole,pH7.4）， 采用線性梯度洗脫方 法，start buffer 和elution buffer分別以0%～100%的比例進(jìn)柱，即咪唑濃度逐漸增加，分別收集蛋白流出液和洗脫蛋白液，并SDS-PAGE檢測。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

收集的蛋白行15%SDS-PAGE，恒壓90V100min。電泳結(jié)束后考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

1.2.5 Western-blot和生物質(zhì)譜檢測

1.2.5.1 Western-blot檢測 蛋白經(jīng)SDSPAGE后,23 V，45 min將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC）上,膜以封閉液封閉過夜,加入1∶1000稀釋的His抗體,37℃孵育4 h后,洗滌NC膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:50000），37℃孵育2 h，洗滌NC膜3次，最后用ECL顯色曝光。

1.2.5.2 生物質(zhì)譜進(jìn)行分子量和序列分析 純化后的重組Neuritin蛋白制作凍干粉，MALDI-TOFMS由北京毅新興業(yè)科技有限發(fā)展公司完成，獲得Neuritin重組蛋白精確的分子量和肽質(zhì)量指紋圖譜（Peptide mass finger-priting,PMF）。應(yīng)用 Mascot搜索引擎在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索，結(jié)果的可靠性用序列覆蓋率進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Neuritin蛋白的純化結(jié)果

采用線性梯度洗脫，收集蛋白流出液和洗脫蛋白液（圖 1）。

圖1 Neuritin蛋白的親和層析色譜圖Fig.1 Affinity chromatography of Neuritin protein

SDS-PAGE檢測所收集的蛋白（圖2），分子量大約11 ku，與理論值（包括6個His插入序列，共計93個氨基酸，理論值11.16 ku）相符。

圖2 15﹪SDS-PAGE分析純化的融合蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis of identified Neuritin-His fusion protein

2.2 純化后的Neuritin蛋白Western blot鑒定結(jié)果

純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后，利用His抗體對該蛋白行免疫印跡分析，由結(jié)果（圖3）可見，有與His抗體特異結(jié)合的蛋白條帶，分子量與理論值相符。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot鑒定結(jié)果Fig.3 Western-blot results of expression products of GS115/pPIC9K-neuritin

2.3 Neuritin重組蛋白的分子量測定結(jié)果

MALDI-TOF-MS測得的Neuritin重組蛋白的分子量結(jié)果見圖4，橫坐標(biāo)顯示質(zhì)量電荷比(m/z)，蛋白質(zhì)分子離子化后通過質(zhì)量分析器對其質(zhì)量電荷比進(jìn)行分析，結(jié)果得到樣品的精確分子量為10965.6621 u。

圖4 Neuritin重組蛋白的MALDI-TOF-MS分子質(zhì)量質(zhì)譜圖Fig.4 Molecular mass spectrum of Neuritin recombination protein

2.4 Neuritin重組蛋白的肽指紋圖譜測定結(jié)果分析

采用MALDI-TOF-MS，對酶解后的Neuritin重組蛋白肽段進(jìn)行肽指紋圖譜測定（圖5）。

圖5 Neuritin重組蛋白的MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜Fig.5 PMF of neuritin recombination protein

應(yīng)用Mascot搜索引擎在SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫 中輸入Neuritin蛋白肽指紋圖譜后檢索肽段序列的覆蓋率。紅色標(biāo)注為匹配片段（圖6），其中HHHHHHAGK為蛋白第 1～9個氨基酸，LGDSMANYPQGLDDK為蛋白第 24～38個氨基酸，NLNIQGSLFELCGSG為蛋白第79～93個氨基酸，總覆蓋率41.9%，提示純化后的蛋白很可能是Neuritin重組蛋白。

圖6 應(yīng)用SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫檢索PMFFig.6 Searcher for PMF in the SwissProt Databas

3 討論

Neuritin是近年發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在研究和應(yīng)用前景方面具有較明顯的優(yōu)勢。首先，Neuritin能促進(jìn)突起生長[5]、維持神經(jīng)元存活[6]。其次，Neuritin為僅含一條肽鏈的蛋白質(zhì)，可以利用基因工程方法制備人源性制品，克服了鼠源性神經(jīng)營養(yǎng)因子無法避免的免疫原性弊端。第三，Neuritin基因工程產(chǎn)品可通過微生物發(fā)酵大量獲取，利于研究及大規(guī)模應(yīng)用。因此，開發(fā)Neuritin基因工程產(chǎn)品，有助于深入挖掘Neuritin功能，為神經(jīng)損傷后的修復(fù)及再生奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個真核表達(dá)系統(tǒng)，非常適合于真核生物蛋白質(zhì)的表達(dá)。由于該表達(dá)系統(tǒng)有很強的真核蛋白質(zhì)修飾功能，重組蛋白能在菌體內(nèi)得到正確折疊和糖基化修飾，因此廣泛應(yīng)用于基因工程產(chǎn)品的研制和開發(fā)。

本實驗室構(gòu)建的GSll5／pPIC9K-Neuritin畢赤酵母工程菌株中，Neuritin的N端插入6個組氨酸序列。6個組氨酸作為標(biāo)簽蛋白由于分子量小，一般不影響蛋白的折疊和干擾Neuritin蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；另外Ni2+與6×His融合蛋白的結(jié)合非常有效，因此允許融合蛋白Neuritin-His結(jié)合到Ni2+螯合表面上，操作簡便快速，有利于蛋白的純化并且在非變性條件下進(jìn)行，保持了目的蛋白的生物學(xué)活性，純化后的Neuritin蛋白可直接用于功能研究，所以本研究選用Ni2+螯合層析進(jìn)行純化。

氨基酸序列覆蓋率分析發(fā)現(xiàn)，匹配的序列并不是很多，可能是Neuritin重組蛋白酶解后某些肽段的特征不明顯，不能在數(shù)據(jù)庫中檢出。雖然測得的序列覆蓋率可以說明純化的蛋白很可能為Neuritin重組蛋白，但為了進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，我們將進(jìn)行氨基酸序列測定。在目前的情況下，氨基酸全序列測定仍然比較困難，且費用昂貴，因此下一步?jīng)Q定通過EDMAN降解法測定純化蛋白的N端和C端序列。

對Neuritin蛋白純化的研究，可以得到較多較純的Neuritin蛋白，為后續(xù)的關(guān)于神經(jīng)方面的功能研究以及Neuritin蛋白的大規(guī)模純化奠定基礎(chǔ)，因此具有很好的意義。

[1]Bonnet D,Garcia M,Vecino E,et al.Brain-derived neurotrophic factor signalling in adult pig retinal ganglion cell neurite regeneration in vitro[J].Brain Research,2004,1007(12):142-151.

[2]Wirenfeldt M,Babcock A A,Ladeby R,et al.Reactive microgliosis engages distinct responses by microglial subpopulations after minor central nervous system injury[J].Neuroscience Research,2005,82(4):507-514.

[3]Lobner D,Ali C.Mechanisms of bFGF and NT-4 potentiation of necrotic neuronal death[J].Brain Research,2002,954(1):42-50.

[4]Nedive E,Hevroni D,Naot D,et al.Numerous candidate plasticity-related genes revealed by differential cDNA cloning[J].Nature,1993,363(24):718-722.

[5]Naeve G S,Ramakkrishnan M,Kramer R,et al.Neuritin:a gene induced by neural activity and neurotrophins that promotes neuritogenesis[J].Proc Natl Acad.Sci.USA Neurobiology,1997,94(6):2648-2653.

[6]Putz U,Harwell C,Nedivi E.Soluble CPG15 expressed during early development rescues cortical progenitors from apoptosis[J].Nature Neuroscience,2005,8(3):322-331

[7]Pahnke J,Mix E,Knoblich R,et al.Overexpression of glial cell line-derived neurotrophic factor induces genes regulating migration and differentiation of neuronal progenitor c ells[J].Experiment Cell Research,2004,297(2):484-494.

[8]Di Giovanni S,Faden A I,Yakovlev A,et al.Neuronal plasticity after spinal cord injury:identification of a gene cluster driving neurite outgrowth[J].The FASEB Journal,2005,19(1):153-154.

[9]Wibrand K,Messaoudi E,Havikel B,et al.Identification of genes co-upregulated with Arc during BDNF-induced long-term potentiation in adult rat dentate gyrus in vivo[J].European Journal of Neuroscience,2006,23(6):1501-1511.

[10]Han D,Qin B,Liu G,et al.Characterization of neuritin as a novel angiogenic factor[J].Biochemical and biophysical research communications,2011,415(4):608-612.