MADS－box基因家族在蒺藜苜蓿的全基因組分析

張軍，宋麗莉，郭東林，郭長(zhǎng)虹，束永俊

（黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150025）

MADS－box基因家族是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛地存在于動(dòng)物、植物和真菌等真核生物，它們?cè)贜端含有一個(gè)由58～60個(gè)氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，稱為 MADS－box結(jié)構(gòu)域［1－2］。MADS－box是一個(gè)可以結(jié)合DNA序列的結(jié)構(gòu)域，它可以識(shí)別結(jié)合CArG基序（CC［A／T］6GG），并激活下游基因的表達(dá)［3］。根據(jù)分子系統(tǒng)進(jìn)化分析，MADS－box基因家族可以分為兩大類(lèi)：I型和Ⅱ型，其中：Ⅰ型主要是指含有SRF結(jié)構(gòu)域，Ⅱ型主要含有MEF2類(lèi)似結(jié)構(gòu)域和植物中特異的MIKC類(lèi)MADS－box基因。結(jié)合MADS－box基因的結(jié)構(gòu)特征，可以將MADS－box家族分成5個(gè)小類(lèi)：Ⅰ型的 Mα、Mβ和 Mγ；Ⅱ型的 MIKC和 MIKC＊［1－2］。

在植物基因組中，MIKC類(lèi)MADS－box轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能研究比較清楚，它們通常含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為：MADS－box（M）、Intervening domain（I）、Kertain－like domain（K）和 C－terminal domain（C）［3］。這些轉(zhuǎn)錄因子在植物基因組特有的，在各種植物基因組之間是非常保守的，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育等過(guò)程起到重要的調(diào)控作用，比如：SOC1（SUPPRESSOR OF OVERESPRESSION OF CONSTANS1）、FLC1（FLOWERING LOCUS c），AGL24（AGAMOUS－LIKE GENE 24）、MAF1／FLM （MADS AFFECTING FLOWERING）和SVP （SHORT VEGETATIVE PHASE）等 MADS－box基因調(diào)控植物的開(kāi)花時(shí)間［4－9］；AP1（APETALA 1）、FUL（FRUITFUL）和CAL（CAULIFLOWER）等 MADS－box基因調(diào)控花芽組織的形成［10－12］；AP1、SEP1－3（SEPALLATA 1－3）、AP3（APETALA 3）、PI（PISTILLATA）和 AG（AGAMOUS）等 MADS－box基因控制植物花器官的形成和種子的發(fā)育［13－15］。

根據(jù)分類(lèi)學(xué)定義：苜蓿屬含有4個(gè)亞屬，56個(gè)種，其中最受科研人員關(guān)注的有：紫花苜蓿（Medicagosativa）和蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）兩個(gè)種。紫花苜蓿是四倍體植物，具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，是全世界種植范圍最廣的牧草作物；蒺藜苜蓿是二倍體植物，其基因組較?。s470Mb），已經(jīng)完成基因組測(cè)序，成為研究豆科，特別是苜蓿屬（如紫花苜蓿）的模式植物［16－18］。在紫花苜蓿長(zhǎng)期種植生產(chǎn)過(guò)程中，科研人員多重視苜蓿營(yíng)養(yǎng)體性狀，如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等，對(duì)苜蓿生殖過(guò)程性狀關(guān)注較少，導(dǎo)致紫花苜蓿的種子生產(chǎn)水平一直低下，嚴(yán)重制約了紫花苜蓿的種植推廣［17］，同時(shí)，其他草類(lèi)植物也存在類(lèi)似的問(wèn)題［19－20］。

本研究將對(duì)蒺藜苜蓿的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域搜索，鑒定MADS－box基因家族成員。通過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，完成MADS－box基因家族成員的分類(lèi)，同時(shí)，根據(jù)MADS－box基因家族的染色體定位信息，明確其在基因組的分布特征。最后，結(jié)合蒺藜苜蓿的RNA－seq數(shù)據(jù)，分析MADS－box家族在蒺藜苜蓿心皮和花等生殖器官發(fā)育過(guò)程的表達(dá)譜，為解析蒺藜苜蓿中MADS－box基因家族的重要作用提供參考。

1 材料與方法

1．1 數(shù)據(jù)來(lái)源

蒺藜苜?；蚪M測(cè)序數(shù)據(jù)、基因轉(zhuǎn)錄序列、CDS序列、蛋白質(zhì)序列及其注釋信息［18］（版本為：Mt4．0v1）均下載自JCVI（http：／／www．jcvi．org／medicago／）。

1．2 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的鑒定和分類(lèi)

MADS－box基因的結(jié)構(gòu)域信息（PF00319）下載自Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)［21］，利用軟件 HMMER［22］（V3．0）搜索蒺藜苜蓿的蛋白質(zhì)序列，運(yùn)行參數(shù)為：－E 0．01。將挖掘的MADS－box基因比對(duì)擬南芥的 MADS－box基因，根據(jù)擬南芥的MADS－box基因分類(lèi)信息對(duì)蒺藜苜蓿MADS－box基因家族進(jìn)行分類(lèi)。同時(shí)，提取蒺藜苜蓿 MADS－box基因的注釋信息，確定其內(nèi)含子分布信息。

1．3 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

提取蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的蛋白質(zhì)序列，利用ClustalW2［23］進(jìn)行多重序列比較，比對(duì)結(jié)果采用MEGA4［24］進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，系統(tǒng)進(jìn)化分析參數(shù)如下：1）建樹(shù)方法為鄰近法（neighbor－joining，NJ）；2）遺傳距離為泊松距離（Poisson correction）；3）抽樣次數(shù)為1000（bootstrap：1000replications）。

1．4 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的染色體定位分析

從蒺藜苜?；蚪M中提取MADS－box基因的基因組序列和CDS序列，利用BLAST［25］進(jìn)行兩兩比對(duì)。當(dāng)2個(gè)MADS－box基因的一致性超過(guò)85%時(shí)，則將這2個(gè) MADS－box基因之間存在基因復(fù)制（gene duplication）。提取所有MADS－box基因在蒺藜苜?；蛑械奈恢眯畔?，結(jié)合MADS－box基因間的基因復(fù)制情況，利用軟件CIRCOS［26］繪制MADS－box基因家族在蒺藜苜?；蚪M中的分布情況。

1．5 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的表達(dá)分析

蒺藜苜蓿的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA－seq）數(shù)據(jù)［18］下載自 NCBI的SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov，登錄號(hào)為：SRR350517－SRR350521，SRR350538和SRR349692）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包含蒺藜苜蓿的根部（root），根部結(jié)瘤（nodule），葉片（blade），芽（bud），心皮（seedpod）和花（flower）6個(gè)組織和部位。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用 TopHat［27］和Cufflink［28］進(jìn)行分析，獲得蒺藜苜?；虻谋磉_(dá)量（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped，F(xiàn)PKM值）。利用MATLAB（R2008B）提取 MADS－box基因的表達(dá)量，去除表達(dá)量較低的 MADS－box基因（FPKM值小于1），然后，對(duì)剩下的 MADS－box基因表達(dá)量進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和標(biāo)準(zhǔn)化，最后，對(duì)蒺藜苜蓿MADS－box基因的表達(dá)情況進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的鑒定和分類(lèi)

通過(guò)HMMER搜索，蒺藜苜?；蚪M總共鑒定出138個(gè)MADS－box基因家族成員，如表1所示。這些MADS－box基因主要分成兩大類(lèi)，即Ⅰ型和Ⅱ型MADS－box基因，其中：Ⅱ型MADS－box基因有46個(gè)，包含有MIKC（41個(gè)）和 MIKC＊（5個(gè)）兩類(lèi)；Ⅰ型 MADS－box基因有92個(gè)，包含有 Mα（49個(gè)）、Mβ（7個(gè)）和 Mγ（36個(gè)）3類(lèi)。兩類(lèi)MADS－box基因中，Ⅱ型MADS－box基因大多數(shù)都含有多個(gè)內(nèi)含子，多數(shù)為6～8個(gè)，甚至超過(guò)10個(gè)，如MtMADS044，45和46都含有10～11個(gè)內(nèi)含子；而Ⅰ型MADS－box基因大多數(shù)不含有內(nèi)含子或者含有1個(gè)內(nèi)含子。與其他植物相比，蒺藜苜?；蚪M中MADS－box基因家族成員總數(shù)差別不大，如擬南芥為107，水稻為75，大豆為106，但是，成員組成差異較大，蒺藜苜蓿Ⅱ型與Ⅰ型分別為46和92個(gè)，Ⅱ型占總MADS－box基因家族的33%，擬南芥為42%，水稻為57%［29］，大豆為68%［30］，蒺藜苜蓿的Ⅱ型MADS－box基因比例明顯偏低。

表1 蒺藜苜?；蚪M中鑒定的MADS－box基因Table 1 The MADS－box genes identified in M． truncatula

續(xù)表1 Continued

2．2 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ClustalW2和MEGA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，如圖1所示。結(jié)果顯示，在系統(tǒng)進(jìn)化上，Ⅱ型和Ⅰ型MADS－box基因是各自獨(dú)立系統(tǒng)演化，兩種之間沒(méi)有交叉。其中：Ⅱ型中的MIKC類(lèi)保守性較好，獨(dú)自分成一支；MIKC＊類(lèi)保守性稍微弱一些，分成兩鄰近的兩支；Ⅰ型的3個(gè)類(lèi)：Mα、Mβ和Mγ，總體上系統(tǒng)分類(lèi)良好，大多數(shù)成員都可以正確的分類(lèi)，只有MtMADS073、130和134這3個(gè)成員進(jìn)化關(guān)系出現(xiàn)不一致。這也說(shuō)明通過(guò)MADS－box基因在植物中保守性較強(qiáng)，可以通過(guò)擬南芥的分類(lèi)信息鑒定蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的分類(lèi)情況。

2．3 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的染色體定位分析

通過(guò)提取蒺藜苜蓿MADS－box基因的染色體定位信息，發(fā)現(xiàn)4個(gè)（MtMADS001、47、48和96）定位在尚未完全組裝的長(zhǎng)片段上，剩下的134個(gè)成員定位在8條染色體上，如圖2所示。每條染色體分布有5～27個(gè)MADS－box基因，其中：1號(hào)染色體最多為27個(gè)，其次為3號(hào)和4號(hào)染色體，分別為26和23個(gè)；6號(hào)染色體最少，只有5個(gè)。此外，MADS－box基因家族在蒺藜苜蓿染色體組上不是均勻分布，它們呈聚集形式分布，如1，3，4和5號(hào)染色體上都有多個(gè)MADS－box的基因簇。通過(guò)兩兩比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)：多數(shù)蒺藜苜蓿MADS－box基因都擁有2個(gè)或以上的拷貝，即存在基因復(fù)制情況，其中：Ⅱ型MADS－box基因成員復(fù)制較少，如圖2中紅色（MIKC）和淺紅色（MIKC＊）線條所示，Ⅰ型的基因復(fù)制較多，如圖2中藍(lán)色（Mα）、淺藍(lán)色（Mβ）和紫色（Mγ）線條所示。

2．4 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的表達(dá)分析

通過(guò)下載NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中蒺藜苜蓿的RNA－seq數(shù)據(jù)，分析得到蒺藜苜蓿MADS－box基因家族在6種組織的表達(dá)譜。蒺藜苜蓿的表達(dá)譜顯示，多數(shù)MADS－box基因（91／138，66%）FPKM都小于1，說(shuō)明這些MADS－box基因在6種組織中的表達(dá)量極低或者不表達(dá)，其中：Ⅰ型MADS－box基因有75個(gè)，Ⅱ型MADS－box基因有26個(gè)。剩下47個(gè)MADS－box基因的表達(dá)譜進(jìn)行聚類(lèi)分析，如圖3所示。根據(jù)表達(dá)譜信息，47個(gè)基因主要可以分成3組：A組含有13個(gè)基因，其中Ⅰ型8個(gè)，Ⅱ型5個(gè)，主要在蒺藜苜蓿的心皮和花等生殖器官中表達(dá)；B組含有16個(gè)基因，其中Ⅰ型9個(gè)，Ⅱ型7個(gè)，這些MADS－box基因雖然表達(dá)，但是在各種組織中表達(dá)量都不高；C組含有12個(gè)基因，其中Ⅰ型4個(gè)，Ⅱ型8個(gè)，主要在蒺藜苜蓿的根部、結(jié)瘤、葉片和芽中表達(dá)，在心皮和花組織中表達(dá)量較低。

圖1 蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig．1 Phylogenetic tree of MADS－box gene family in M． truncatula

3 討論

圖2 蒺藜苜蓿MADS－box基因在染色體定位Fig．2 Chromosomal locations of MADS－box genes in M． truncatula

圖3 蒺藜苜蓿MADS－box基因表達(dá)的聚類(lèi)分析Fig．3 Heat map of MADS－box gene expression obtained from RNA－seq in M． truncatula

通過(guò)全基因組分析，從蒺藜苜蓿中鑒定了138個(gè)MADS－box基因，其中Ⅱ型MADS－box基因46個(gè)，這與擬南芥（Arabidopsisthaliana，45個(gè)）和水稻（Oryzasativa，43個(gè)）等植物的報(bào)導(dǎo)一致，但是比大豆（Glycinemax）中Ⅱ型MADS－box基因（72個(gè)）要少，這可能是由于大豆基因組發(fā)生加倍，是古四倍體造成。同時(shí)，Ⅱ型MADS－box基因一般含有多個(gè)內(nèi)含子，Ⅰ型一般不含有或者只含有1個(gè)內(nèi)含子，通常含有多個(gè)內(nèi)含子的基因一般比較保守，而不含有內(nèi)含子的基因保守性較差［1，9］。此外，蒺藜苜蓿的Ⅰ型和Ⅱ型MADS－box基因在基因組分布模式也有差異，Ⅱ型基本上遍布基因組各條染色體上（2～10個(gè)），比較均勻；Ⅰ型只是集中在少數(shù)染色體上，如：1號(hào)染色體（22個(gè)）和3號(hào)染色體（19個(gè)），其他染色體（6號(hào)染色體，3個(gè)）上極少，呈基因簇狀分布。最后，比較基因組學(xué)和表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，蒺藜苜蓿的Ⅰ型MADS－box基因含有大量的復(fù)制基因，大多基因都不表達(dá)或者表達(dá)量極低；而Ⅰ型MADS－box基因的復(fù)制較少，且表達(dá)模式較為穩(wěn)定。綜合上面可以發(fā)現(xiàn)，在蒺藜苜?；蚪M中，Ⅰ型MADS－box基因處于積極復(fù)制的“擴(kuò)張期”，雖然基因數(shù)量較多，但是參與調(diào)控的過(guò)程較少；而Ⅱ型MADS－box基因基本進(jìn)入“穩(wěn)定期”，基因復(fù)制較少，家族成員數(shù)量也較少，但是，這些基因保守性好，積極參與蒺藜苜蓿器官形成和發(fā)育等過(guò)程的調(diào)控。

通過(guò)蒺藜苜蓿的RNA－seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)Ⅰ型MADS－box基因成員不表達(dá)或者表達(dá)量極低，而Ⅱ型MADS－box的表達(dá)量相對(duì)較高，這也為Ⅱ型MADS－box基因在蒺藜苜蓿的器官發(fā)育和形態(tài)建成過(guò)程中的重要調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。在蒺藜苜蓿MADS－box基因家族的表達(dá)譜中，A組基因（圖3）主要是調(diào)控蒺藜苜蓿生殖器官花和心皮的發(fā)育和形成，其中Ⅱ型MADS－box基因有5個(gè)。通過(guò)同源搜索和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，它們分別屬于SEP（MtMADS012和 MtMADS020）、AP3／PI（MtMADS014和 MtMADS044）和 AP1（MtMADS039）等亞家族，在擬南芥、水稻等植物中，這3個(gè)亞家族也參與花等生殖器官的發(fā)生和形成，說(shuō)明這些MADS－box基因的功能高度保守，在蒺藜苜蓿中也通過(guò)這些MADS－box基因的表達(dá)調(diào)控控制花等生殖器官的形態(tài)發(fā)生。此外，C組基因主要調(diào)控蒺藜苜蓿根部、葉片和芽等組織的分化和形態(tài)形成，其中Ⅱ型MADS－box基因有8個(gè)，分別屬于SOC1（MtMADS017、MtMADS035和 MtMADS036）、ANR1（MtMADS019、MtMADS023和 MtMADS029）以及SVP（MtMADS018和MtMADS028），它們?cè)诟鱾€(gè)組織中表達(dá)量都較高，參與植物各個(gè)器官的發(fā)育，這與其他植物中的報(bào)道類(lèi)似，這就意味著蒺藜苜蓿的Ⅱ型MADS－box基因無(wú)論從結(jié)構(gòu)上，還是表達(dá)模式上，甚至是生物學(xué)功能上都非常保守［1，3，29－30］。

4 結(jié)論

本研究采用結(jié)構(gòu)域搜索的方法，在蒺藜苜?；蚪M中鑒定了MADS－box基因家族的全部基因成員，并通過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化方法，確定了MADS－box基因家族的分類(lèi)和進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)染色體定位分析，研究了蒺藜苜蓿中MADS－box基因家族的演化特點(diǎn)。同時(shí)，結(jié)合RNA－seq的表達(dá)譜，闡述了MADS－box基因家族在植物器官發(fā)育，特別是生殖器官發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控作用，這將為揭示蒺藜苜蓿種子形成機(jī)制提供參考，也為解析紫花苜蓿種子生長(zhǎng)過(guò)程提供重要的借鑒作用。

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