臍帶間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)的實驗研究

[摘要] 目的 建立一種簡單的體外無血清培養(yǎng)擴增人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的方法。 方法 利用酶消化法分離hUCMSCs，在無血清干細胞培養(yǎng)體系下培養(yǎng)擴增，進行形態(tài)學(xué)觀察，CCK-8法分析細胞生長曲線，流式細胞儀分析細胞表面抗原表達及細胞周期，進行成骨、成脂誘導(dǎo)分化。 結(jié)果 hUCMSCs呈典型的成纖維細胞形態(tài)，具有較強的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達，而CD34、CD45呈陰性表達。3周可誘導(dǎo)分化為脂肪細胞和成骨細胞。 結(jié)論 利用酶消化法和無血清的培養(yǎng)體系能夠快速分離培養(yǎng)出大量hUCMSCs，該方法擴增得到的間充質(zhì)細胞具備穩(wěn)定的細胞標記物和生長狀態(tài)，可用于各種治療的臨床試驗。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細胞；臍帶；無血清培養(yǎng)液；細胞培養(yǎng)

[中圖分類號] R446.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）27-0085-03

hUCMSCs因來源豐富、體外擴增能力強、免疫原性低、無倫理問題等受到干細胞研究者的重視。無血清培養(yǎng)基因組分較明確，減少了異種血清臨床應(yīng)用的潛在危險。本實驗應(yīng)用無血清培養(yǎng)體系分離培養(yǎng)hUCMSCs，解決其臨床應(yīng)用的生物安全性問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

間充質(zhì)干細胞無血清條件培養(yǎng)基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉諾生物），Ⅰ型膠原酶（Sigma），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105 （BD Biosciences），anti-CD34（Santa Cruz Biotechnology），anti-CD44（Abcam），細胞周期即時檢測試劑盒（凱基生物），成骨及成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液、茜素紅、油紅O （Cyagen）。臍帶取自剖腹產(chǎn)足月胎兒，由解放軍117醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，產(chǎn)婦及家屬對實驗均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 hUCMSCs的分離培養(yǎng)及傳代 無菌PBS漂洗新生兒臍帶，剪成3 cm的小段，剝離血管，用PBS洗滌干凈，剪碎后放入離心管中。加入10 mL 0.2%Ⅰ型膠原酶及5 mL PBS置于37℃孵箱中消化過夜。加入10 mL 0.25%胰酶-0.02%EDTA，37℃消化45min后，200目濾網(wǎng)過濾掉較大團塊，用PBS充分稀釋，反復(fù)混勻后分裝入離心管中，室溫3 000 rmp離心20 min。棄上清，加入適量培養(yǎng)基混勻。細胞計數(shù)，接種密度為106個/cm2，置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。3～5 d后換液，洗去懸浮的組織和細胞。待細胞生長至80%融合時，PBS清洗2次，加入1 mL預(yù)熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細胞變圓后，用舊培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打，吸取細胞懸液于離心管中，室溫300 g離心10 min。收集細胞，并計數(shù)，以5×103/cm2的接種密度進行傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性 取生長狀態(tài)良好的第3代細胞，調(diào)整細胞濃度至2×107/L加入96孔板，每孔100 μL，放在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7d內(nèi)在特定時間點，取出96孔細胞培養(yǎng)板每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1 h。用酶標儀（波長450 nm）測定各孔吸光度值（OD值），以O(shè)D值代表細胞的相對數(shù)量，繪制細胞生長曲線。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 取對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)消化，1500r/min離心5min，取細胞懸液100 μL（含有2×105個細胞）。加入200 μL預(yù)冷乙醇固定，室溫孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，盡量避免產(chǎn)生氣泡，室溫孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室溫避光孵育15 min，上機檢測。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞表面抗原 取生長狀態(tài)良好的細胞，消化并計數(shù)，以每管含1×106個細胞，分別加入10 μL單克隆抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105，同型對照10 μL作為陰性對照，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次，室溫300 g離心5 min，PBS重懸后，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 成脂、成骨誘導(dǎo)分化 待第3代細胞達80%融合，常規(guī)消化，以5×104/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板（成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)皿底部包被明膠），常規(guī)培養(yǎng)，待細胞達80%融合時，成脂、成骨誘導(dǎo)組分別加入2 mL成脂、成骨誘導(dǎo)分化液，對照組加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，一周換液2～3次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)與生長情況，3周后分別進行油紅O、茜素紅染色。

2 結(jié)果

2.1細胞基本生物學(xué)特征

酶消化法獲得的細胞4d后有大量細胞貼壁，部分細胞伸出偽足，形態(tài)不一，見封三圖4A。經(jīng)過約8d培養(yǎng)后細胞匯合成片，呈均一的成纖維細胞形態(tài)。傳代后細胞較快貼壁伸展，增殖較快，培養(yǎng)3d細胞可達80%融合，見封三圖4B。CCK-8法檢測細胞生長曲線呈S型，細胞接種后1～2 d為適應(yīng)期，第2～5天為快速增長期，隨后進入平臺期，符合正常細胞的生長特性，見圖1。

2.2 細胞生長周期

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，第3代hUCMSCs中G0/G1期細胞為78.87%，G2期細胞為3.96%，S期細胞為5.46%，見圖2。

2.3 hUCMSCs表面標記物的表達

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，細胞CD29、CD44、CD90、CD105陽性率分別為99.9%、96.4%、98.5%、94.1%，而CD34、CD45陽性率分別為0.262%、0.125%，驗證此細胞為間充質(zhì)干細胞，而非造血干細胞來源，純度較高，見圖3。

2.4 成脂、成骨誘導(dǎo)分化鑒定

成脂誘導(dǎo)組細胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)閳A形，3周后有成串的脂滴形成，油紅O染色后呈現(xiàn)橙紅色，見封三圖5A。成骨誘導(dǎo)組細胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，3周后運用茜素紅進行鈣化結(jié)節(jié)染色，可見大量橘紅色致密結(jié)節(jié)形成，見封三圖5B。對照組染色均未見陽性結(jié)果。

3 討論

目前基礎(chǔ)與臨床研究中應(yīng)用的間充質(zhì)干細胞主要來源于成人骨髓，但在衰老和疾病情況下其數(shù)量和擴增、分化能力顯著下降，取材過程會給患者帶來創(chuàng)傷，面臨醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的困擾，使其在臨床應(yīng)用受到一定限制。臍帶是孕婦與胎兒之間的物質(zhì)交通支，是分娩后的廢棄物，來源豐富，收集臍帶對產(chǎn)婦和胎兒均不造成傷害。與骨髓MSCs相比，hUCMSCs增殖潛能、活性更高，免疫原性相對較低[1]。Ma等[2]研究發(fā)現(xiàn)人臍帶沃頓膠中的MSCs不表達移植物抗宿主病相關(guān)的抗原MHC-II，在免疫抑制治療方面具有積極的臨床應(yīng)用前景[3]，有望代替骨髓干細胞成為一種新的MSCs來源。

已有多篇文獻報道成功分離培養(yǎng)UCMSCs[4]，但培養(yǎng)體系中加入了一定比例的血清如胎牛血清、臍血血清、正常人的AB血清等。血清含豐富的營養(yǎng)成分、細胞因子、微量元素以及貼壁因子等，有利于細胞的生長。添加胎牛血清的培養(yǎng)基被認為是體外擴增MSCs最有效的培養(yǎng)基。但是，血清中的成分尚不明確，可能攜帶病原體、異種蛋白抗原，在生產(chǎn)臨床級別的細胞產(chǎn)品時，理論上會導(dǎo)致病原體的傳播及臨床排斥反應(yīng)?；谀軌蛱峁?yīng)用于臨床的MSCs為目標，本實驗選擇了無血清的MSCs專用培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，避免以往使用任何人與動物血清培養(yǎng)體系，為MSCs臨床應(yīng)用安全性、有效性的標準化提供有益的依據(jù)。

目前分離hUCMSCs主要有組織塊貼壁法[5]及酶消化法[6]兩種。前一種方法費時較長，很難徹底分離臍帶組織中的干細胞，傳代后純化時間長，很難短時間內(nèi)獲得大量種子細胞滿足臨床細胞移植的需要。采用膠原酶消化法可快速獲得大量貼壁生長的原代細胞，操作簡便易行，凍存復(fù)蘇后免疫表型無顯著變化，保持較好的細胞活力[7]。吳偉等[8]利用化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)擴增骨髓MSCs，可以維持干細胞特性，用于細胞治療以及生物醫(yī)學(xué)研究。方彥艷等[9]利用無血清的人MSCs專用培養(yǎng)基培養(yǎng)體系，臍帶組織培養(yǎng)法能夠分離培養(yǎng)出大量MSCs，避免了培養(yǎng)中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應(yīng)。

應(yīng)用該培養(yǎng)體系，hUCMSCs傳代后3d就可達到80%～90%融合，CCK-8法檢測細胞增殖率發(fā)現(xiàn)，細胞體外擴增和自我更新能力很強。流式細胞術(shù)分析顯示無血清培養(yǎng)條件下78%細胞處于細胞周期的G0/G1期，符合干細胞的慢周期特性。體外培養(yǎng)的細胞經(jīng)流式細胞儀檢測均一性好，CD29、CD44、CD90、CD105均呈強陽性表達，但不表達CD34（造血前體細胞表面標志） 和CD45（白細胞抗原），證明此細胞非造血干細胞來源。經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)液體外培養(yǎng)后，hUCMSCs具有良好的成骨、成脂分化能力。細胞貼壁能力很強，呈漩渦狀的集落形態(tài)特征，具有強大的增殖能力。以上特征與Bruyn等[10]報道的結(jié)果一致，符合國際細胞治療委員會規(guī)定的間充質(zhì)干細胞的三條鑒定標準。研究表明，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基體系酶消化法可快速獲得足夠應(yīng)用于臨床治療級細胞數(shù)量，為下一步體外定向誘導(dǎo)hUCMSCs向肝樣細胞分化，為肝組織工程提供種子細胞來源。

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（收稿日期：2013-07-25）