番茄紅素抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 探討番茄紅素對體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用。 方法 用CCK-8 法檢測不同濃度番茄紅素作用于U251細(xì)胞24 h、48 h 及72 h后細(xì)胞的存活率；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞周期。 結(jié)果 番茄紅素能抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的生長，呈量-效及時(shí)-效關(guān)系（P<0.01）；FCM 檢測表明，細(xì)胞主要被阻滯在G0/G1期；番茄紅素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加（P<0.01），具有濃度依賴性。 結(jié)論 番茄紅素能抑制U251 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 番茄紅素；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號] R730.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）27-0003-02

番茄紅素是番茄等植物中含有的一種具有抗癌活性的烴類類胡蘿卜素A，研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素通過抗氧化、清除組織自由基及調(diào)控癌細(xì)胞增殖等作用促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究旨在從細(xì)胞凋亡方面探討番茄紅素對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞生長的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251（購于武漢博士德生物工程有限公司），番茄紅素（購自成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司），四氫呋喃（THF，稀釋番茄紅素用），細(xì)胞增殖檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（購自武漢博士德生物工程有限公司），流式細(xì)胞儀（FCM，美國BD公司），酶聯(lián)免疫儀（中科院生產(chǎn)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將U251細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液中（含有100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、0.2%NaHCO3及10%胎牛血清），放在5%CO2、37℃孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 檢測番茄紅素對細(xì)胞增殖的作用（CCK-8法）

將濃度為1×104個(gè)/mL的對數(shù)期U251 細(xì)胞接種至96孔板內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)按時(shí)間長短（24 h、48 h、72 h）分三組，每組再分為不同濃度（0.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L）的番茄紅素處理組及只有稀釋溶劑THF的空白對照組，每組設(shè)立5個(gè)重復(fù)孔加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。各組細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)（細(xì)胞相對穩(wěn)定）后更換為對應(yīng)濃度番茄紅素的培養(yǎng)液，再經(jīng)不同時(shí)間（24 h、48 h及72 h）培養(yǎng)后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液后孵育1 h，觀察各組細(xì)胞的生長狀態(tài)，用酶標(biāo)儀檢測其在450 nm波長時(shí)的光密度值 。

1.4 檢測細(xì)胞周期

培養(yǎng)48 h后，收集不同濃度（0.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L）的番茄紅素處理組及稀釋溶劑THF空白對照組，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/mL，分別取5 mL實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行相關(guān)處理后，F(xiàn)CM檢測各組U251腫瘤的細(xì)胞周期分布。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同實(shí)驗(yàn)組間采用單因素方差分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響

番茄紅素對人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的抑制作用：檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率（使用CCK-8法），當(dāng)前存活率即同一濃度處理組OD 值均值與對照組OD 值均值的比值乘以100%（設(shè)對照組存活率為100%）。實(shí)驗(yàn)證明：不同濃度與不同的作用時(shí)間沒有交互作用（F=0.54，P>0.05）；相同濃度的番茄紅素隨著時(shí)間的延長，對細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)，在作用時(shí)間一定的情況下，隨著作用濃度的增大，抑制作用也隨之增強(qiáng)，即番茄紅素對U251 細(xì)胞的作用有時(shí)間依賴性（F=509.32，P<0.01）和濃度依賴性（F=58.60，P<0.01）；隨著番茄紅素作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞抑制作用都逐漸加強(qiáng)。見表1。

2.2 番茄紅素對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖指數(shù)及S期比例的影響

FCM 檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡結(jié)果：各不同濃度番茄紅素和THF對照組細(xì)胞分別作用48 h后，測得的細(xì)胞周期，各組G0+G1、S、G2+M 期細(xì)胞所占比例。在作用時(shí)間一定的情況下，G0+G1期比例升高，S期及（G2+M）期比例降低。在作用時(shí)間相同的條件下，增殖指數(shù)（PI）及S期比例（S Phase Fraction，SPF）隨著各組細(xì)胞培養(yǎng)液作用濃度的增加都有所下降。見表2。

3 討論

許多研究表明，蔬菜及水果對預(yù)防及治療人類的癌癥具有積極而有效的作用。近年來發(fā)現(xiàn)番茄紅素是眾多蔬菜及水果提取物質(zhì)中的一種有效的防癌成分[1]。番茄紅素是類胡蘿卜素中的一種，近些年的研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素作為類胡蘿卜素中最強(qiáng)力的抗氧化劑。番茄紅素可以穿過血腦屏障[2]，對膠質(zhì)瘤有潛在的促進(jìn)凋亡和抑制侵襲作用，其防癌抗癌作用日益受到重視。國外研究人員對72項(xiàng)相關(guān)研究進(jìn)行科學(xué)的分析，其中57項(xiàng)研究證明患某些類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)和攝入番茄的劑量及番茄紅素的血液水平呈負(fù)相關(guān)，其中有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有35項(xiàng)，而且沒有一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)番茄紅素可以加大患者發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。近年來，陸續(xù)有大量實(shí)驗(yàn)研究證明番茄紅素對前列腺癌、消化道癌癥和肺癌等多種癌癥具有很明顯的預(yù)防及治療作用。相關(guān)實(shí)驗(yàn)還證明患有宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌和消化道癌的概率及該病的死亡率同人體番茄紅素的攝入量及血液濃度成反比[6-8]。番茄紅素抑制癌細(xì)胞的體外研究已有很多報(bào)道[9-11]。番茄紅素對多種腫瘤的預(yù)防及治療表現(xiàn)出較好效果，相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)研究證實(shí)番茄紅素可在不傷及正常細(xì)胞的前提下誘導(dǎo)前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，但其對腦膠質(zhì)瘤作用方面的相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)研究旨在使用流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡來證實(shí)番茄紅素可以通過誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡來抑制其生長，這種表現(xiàn)與番茄紅素作用于其他腫瘤細(xì)胞并發(fā)生凋亡的結(jié)果基本相同，均表現(xiàn)為明顯的濃度依賴性，作用濃度越高，其凋亡率越高。至于番茄紅素作用于U251細(xì)胞的具體機(jī)制則需要更深一步的探討。本實(shí)驗(yàn)研究證明，番茄紅素對人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的生長抑制作用呈濃度依賴性及時(shí)間依賴性，表明番茄紅素在體外對U251細(xì)胞具有抗腫瘤活性的作用。

實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞周期的結(jié)果（流式細(xì)胞儀檢測）：番茄紅素作用后U251細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞所占比重隨著濃度的加大而增大，而S期細(xì)胞的比重則有所下降，表明番茄紅素抑制腫瘤細(xì)胞增殖可能與阻滯細(xì)胞在G0/G1期，而進(jìn)入S期的有所減少有關(guān)。有相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)番茄紅素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并能縮小人前列腺癌病灶的大小，也有實(shí)驗(yàn)表明番茄紅素可通過影響乳腺癌、肺癌和子宮癌等細(xì)胞由G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)化來影響抑制腫瘤細(xì)胞的生長[12]。唐莉莉等[13]通過對前列腺癌DU145細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)番茄紅素對DU145抑制率高達(dá)78%，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系；番茄紅素可影響前列腺癌DU145細(xì)胞周期同時(shí)誘發(fā)其凋亡。

本實(shí)驗(yàn)研究證明番茄紅素對體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖有抑制作用并引發(fā)其凋亡，但目前對番茄紅素的抗腫瘤的相關(guān)性研究較少，進(jìn)一步的研究將深入探討番茄紅素對人腦膠質(zhì)瘤的影響機(jī)制，并為番茄紅素臨床治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2013-07-02）