妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥中miR—200c的表達(dá)及其臨床意義

[摘要] 目的 考察miR-200c在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者中的表達(dá)及其在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥中的作用。 方法 提取51例妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者及30例同期正常妊娠婦女外周血RNA，qRT-PCR檢測(cè)miR-200c的表達(dá)。 結(jié)果 miR-200c在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者中表達(dá)為（0.48±0.24），明顯低于正常妊娠婦女中的表達(dá)（1.12±0.35）。血清miR-200c水平與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者的年齡、經(jīng)產(chǎn)與否、孕周、胎數(shù)無(wú)關(guān)，但是與圍產(chǎn)兒預(yù)后相關(guān)。 結(jié)論 血清miR-200c在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的診斷和圍產(chǎn)兒預(yù)后預(yù)測(cè)中可能發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞] 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥；miR-200c；臨床意義

[中圖分類號(hào)] R714.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）23-0034-02

眾所周知，miRNA成為分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，人類miRNA充當(dāng)瘤基因或抑瘤基因的作用調(diào)控其靶基因的表達(dá)及相關(guān)信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-4]。研究表明，miR-200c在乳腺腫瘤中表達(dá)下調(diào)[5，6]。miRNA-200c通過(guò)抑制ZEB1來(lái)增強(qiáng)RASSF1A表達(dá)，進(jìn)而抑制表皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程[7]。結(jié)果提示miR-200c表達(dá)下調(diào)可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是一種在妊娠期出現(xiàn)瘙癢及黃疸為特點(diǎn)的疾病，其早產(chǎn)率及圍生兒死亡率高，其發(fā)病原因尚未完全闡明。本研究旨在分析miR-200c在ICP患者中的表達(dá)及在ICP中的臨床作用，從miRNA的角度探討ICP的進(jìn)展。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

以2010年1月～2012年6月在我院診斷為妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的孕婦51例為研究組，年齡21～37歲，孕周32+1～41周。配對(duì)同期住院30例正常產(chǎn)婦作為對(duì)照組，年齡21～39歲，孕周31+5～41周。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

mirVana PARIS試劑盒（用于提取血清總RNA）購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，miRNA逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，miR-200c的qRT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3 妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的診斷依據(jù)[6]

①中晚期妊娠有全身瘙癢，伴或不伴有黃疸，排除其他皮膚疾病或藥敏性皮炎；②血清膽汁酸≥16 μmol/L，或者血清丙氨酸和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶>31 U/L；③分娩后癥狀及體征消失；④排除其他肝臟疾病。

1.4 標(biāo)本的采集及血清總RNA的提取

與患者簽署知情同意書后，采集外周血樣本5 mL。采血后需來(lái)回輕晃抗凝管，讓血液與管壁的抗凝劑充分接觸，動(dòng)作輕柔以防溶血，1 000 r/min離心10 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至無(wú)酶管，再以10 000 r/min離心10 min，吸取上層血清于無(wú)酶管，-80℃凍存?zhèn)溆?。血清總RNA的提取按照mirVana PARIS試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 血清miR-200c表達(dá)水平的檢測(cè)

①RT反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μL，包括5×RT緩沖液4 μL、25 mmol/L鎂離子3 μL、10 mmol/L三磷酸脫氧核苷0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL、1 μmol/L miR-200c特異性RT引物1.2 μL、200 U/μL莫羅尼鼠白血病病毒RT酶0.2 μL、RNA 1 μg，無(wú)酶水加至20 μL。反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，再以85℃ 10 min滅活RT酶，產(chǎn)物-20℃凍存?zhèn)溆?。②qRT-PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μL，包括稀釋后的RT產(chǎn)物2 μL、2×qRT-PCR緩沖液10 μL、5 μmol/L miR-200c特異性PCR引物0.4 μL、5 U/μL耐熱DNA聚合酶0.2 μL、滅菌雙蒸水7.4 μL。反應(yīng)條件：先95℃ 3 min活化Tag酶，然后95℃ 12 s、62℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0軟件，采用t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-200c在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者及正常妊娠婦女外周血的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，51例妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者血清中miR-200c的表達(dá)為（0.48±0.24），對(duì)照組為（1.12±0.35），與對(duì)照組相比miR-200c下調(diào)0.43倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.007）。

2.2 血清miR-200c水平與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者臨床參數(shù)的關(guān)系

qRT-PCR結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示血清miR-200c與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者的年齡、孕周、經(jīng)產(chǎn)與否及胎數(shù)無(wú)關(guān)（P > 0.05）。血清miR-200c在有圍產(chǎn)兒早產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)的妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者中的表達(dá)顯著下調(diào)，與圍產(chǎn)兒正常的妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.001）。見(jiàn)表1。

3 討論

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥是一種以妊娠期出現(xiàn)瘙癢及黃疸為特點(diǎn)的重要的妊娠期并發(fā)癥。妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的早產(chǎn)率及圍生兒死亡率高，其發(fā)病原因雖未完全闡明，但通過(guò)大量的流行病學(xué)材料以及臨床觀察及實(shí)驗(yàn)室研究，認(rèn)為本病的發(fā)病原因與雌激素、孕激素、發(fā)生率的地區(qū)差異以及遺傳因素有密切關(guān)系[8]。妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)病機(jī)制研究已取得了一定進(jìn)展，但是仍不十分明確。

miRNA是內(nèi)源性的一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)約19～25核苷酸。研究顯示，miRNA分子廣泛參與疾病過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控，而且在疾病中的miRNA通過(guò)外泌泡的形式分泌入血液，其泡內(nèi)的miRNA譜與原發(fā)疾病相似，是一種非常有前景的全新的疾病診斷標(biāo)志物[9]。加之血清miRNA存在于容易獲得的血液樣本內(nèi)，具有很好的臨床應(yīng)用前景。miRNA廣泛存在于健康人群和疾病患者的血清中，并且隨著生理狀況、疾病的種類和病程的不同，miRNA在血清中存在的種類和數(shù)量將發(fā)生變化[10]。由此，我們假設(shè)miRNA在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥中同樣起著重要的作用，并可用于妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的診斷。為了驗(yàn)證此假設(shè)，本研究通過(guò)檢測(cè)血清中miR-200c的表達(dá)分析其在正常妊娠婦女和妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者中的表達(dá)差異。結(jié)果表明，血清miR-200c水平在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者中明顯升高。隨后我們分析了miR-200c與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者臨床參數(shù)的關(guān)系。miR-200c與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者的年齡、孕周、經(jīng)產(chǎn)與否及胎數(shù)無(wú)關(guān)，但與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者圍產(chǎn)兒預(yù)后相關(guān)，圍產(chǎn)兒正常的妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者miR-200c的水平明顯高于圍產(chǎn)兒早產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)的妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者的表達(dá)。因此，血清miR-200c的表達(dá)可作為妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥診斷的輔助檢測(cè)指標(biāo)，也可作為妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥圍產(chǎn)兒預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2013-05-02）