玉米ZmbZIP基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

摘要：根據(jù)玉米（Zea mays）ZmbZIP的基因序列和植物表達(dá)載體pCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的特異性引物，以質(zhì)粒pGM-T-ZmbZIP為模板PCR擴(kuò)增ZmbZIP基因片段，雙酶切目的片段及載體，回收后連接，構(gòu)建該基因的植物表達(dá)載體。結(jié)果表明，擴(kuò)增出的ZmbZIP基因片段長(zhǎng)度為894 bp。經(jīng)PCR檢測(cè)及測(cè)序鑒定，表明植物表達(dá)載體構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：植物表達(dá)載體；玉米（Zea mays）；ZmbZIP

中圖分類號(hào)：S515；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-3175-03

植物堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper， bZIP）蛋白是一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族，它的成員參與調(diào)控逆境應(yīng)答和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1-3]。堿性亮氨酸拉鏈蛋白包含一個(gè)堿性DNA結(jié)合區(qū)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈二聚基序。根據(jù)植物中bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)差異，可將bZIP轉(zhuǎn)錄因子分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S亞族共10個(gè)亞族。研究表明轉(zhuǎn)基因植物過表達(dá)A族bZIP基因可增強(qiáng)植物對(duì)非生物脅迫的忍耐。例如擬南芥AREB1/ABF2是葡萄糖信號(hào)傳遞中的重要元件，它的過表達(dá)影響擬南芥對(duì)多種逆境的忍耐[4，5]，過表達(dá)ABF3或AREB2/ABF4可提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱的忍耐能力[6]。在水稻中，OsbZIP72是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控子，過表達(dá)OsbZIP72增強(qiáng)水稻苗期的抗旱能力[7]。

玉米（Zea mays）是重要的糧食和飼料作物，它的生長(zhǎng)發(fā)育受多種非生物逆境的嚴(yán)重影響[8]，因此揭示玉米非生物逆境應(yīng)答的分子機(jī)制是非常重要的。利用模式植物擬南芥研究基因的功能是目前廣泛采用的方法，而構(gòu)建植物表達(dá)載體是在植物體內(nèi)研究基因功能的前提。因此，本研究構(gòu)建了玉米ZmbZIP基因的植物表達(dá)載體，經(jīng)菌液PCR和測(cè)序鑒定所構(gòu)建載體的正確性，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥研究基因的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司。引物合成及序列測(cè)定由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。含有ZmbZIP基因cDNA序列的pGM-T-ZmbZIP菌液和植物表達(dá)載體pCAMBIA3301菌液由新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系園林教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 根據(jù)ZmbZIP基因cDNA序列和pCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物添加Nco Ⅰ酶切位點(diǎn)，下游引物添加Bgl Ⅱ酶切位點(diǎn)，引物序列為：F，5′-ATACCATGGATGGACGAG

CTGCTCCAGAGC-3′； R，5′-TAAAGATCTTCACCA

GGGGGCCGTCAACGT-3′ （下劃線分別表示NcoⅠ 和Bgl Ⅱ酶切位點(diǎn)）。按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pGM-T-ZmbZIP質(zhì)粒。以pGM-T-ZmbZIP質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括質(zhì)粒（50 ng/μL） 1 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 2 μL、引物（10 μmol/L） 2 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察結(jié)果，采用凝膠回收試劑盒回收長(zhǎng)度正確的擴(kuò)增片段產(chǎn)物。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 按TaKaRa限制性內(nèi)切酶使用說明書推薦體系，用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切ZmbZIP回收產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pCAMBIA3301，酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接目的片段到植物表達(dá)載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取陽性克隆，經(jīng)含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h后，菌液PCR檢測(cè)是否有插入片段，陽性克隆送北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmbZIP基因片段的PCR擴(kuò)增

以含有ZmbZIP基因cDNA序列的質(zhì)粒pGM-T-ZmbZIP為模板，PCR擴(kuò)增帶有Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位點(diǎn)的產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為894 bp，與預(yù)期大小一致（圖1），且產(chǎn)物條帶清晰明亮，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

用Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ雙酶切目的片段和載體后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-ZmbZIP進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果表明，能夠從轉(zhuǎn)化pCAMBIA3301-ZmbZIP的大腸桿菌菌液中擴(kuò)增出大小為894 bp的目的片段，陽性菌液送北京鼎國(guó)昌盛公司測(cè)序，測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，插入序列與ZmbZIP序列完全一致，表明pCAMBIA3301-ZmbZIP載體構(gòu)建成功（圖2）。

3 討論

玉米中存在170個(gè)堿性亮氨酸拉鏈蛋白，但是僅有很少的玉米堿性亮氨酸拉鏈蛋白的功能被研究[9，10]。本研究成功構(gòu)建了玉米ZmbZIP基因的植物表達(dá)載體并采用菌液PCR結(jié)合測(cè)序的方法對(duì)構(gòu)建的植物表達(dá)載體進(jìn)行了鑒定，與酶切鑒定相比，測(cè)序鑒定能夠保證插入片段序列的正確性，只有未發(fā)生堿基突變的序列才能在植物體內(nèi)編碼正確的堿性亮氨酸拉鏈蛋白，行使其生物學(xué)功能。本研究通過測(cè)序驗(yàn)證了插入的ZmbZIP序列與原始序列一致，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化擬南芥揭示ZmbZIP基因的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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