BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合正交試驗法優(yōu)化Bacillus velezensis Z—27菌株培養(yǎng)基組分

摘要：將BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificiai neural network）技術(shù)與傳統(tǒng)的正交試驗方法相結(jié)合，提出一種新的試驗分析和處理方法，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)特有的自學(xué)能力，對主要影響因素進行仿真優(yōu)化，獲得Bacillus velezensis Z-27菌株培養(yǎng)基組分，即玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%，起始pH為7.0、接種量為2.0%，應(yīng)用優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組分進行驗證試驗，取得了較好的效果。

關(guān)鍵詞：BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificiai neural network）；正交試驗；培養(yǎng)基；Bacillus velezensis Z-27菌株

中圖分類號：Q936 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3109-03

近年來，健康和生態(tài)環(huán)境問題日益受到重視，中國已全面啟動實施無毒、無公害的微生態(tài)飼料添加劑工程。農(nóng)業(yè)部于1994年公布的可用于微生態(tài)制劑生產(chǎn)的菌種包括乳酸桿菌、芽孢桿菌、糞鏈球菌、酵母菌和雙歧桿菌。其中芽孢桿菌可以使腸道內(nèi)形成有利于厭氧微生物生長的環(huán)境，從而保持腸道微生態(tài)系統(tǒng)平衡。芽孢桿菌在腸道中還可以產(chǎn)生多種消化酶和有機酸，這有益于提高飼料的利用率，抑制有害菌的繁殖，可為乳酸桿菌等菌群的生長創(chuàng)造有利條件。所以，芽孢桿菌是一種理想的動物微生態(tài)制劑的生產(chǎn)菌種。Z-27菌株[1]是以來自豬糞便的耐高濃度膽酸鹽的產(chǎn)芽孢菌株為出發(fā)菌株，以大腸桿菌為病原指示菌，經(jīng)過初篩、復(fù)篩篩選出的具有較高拮抗活性的芽孢桿菌，對其進行了菌種鑒定，經(jīng)鑒定為Bacillus velezensis。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificiai neural network），簡稱神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，是近幾年迅速發(fā)展起來的一門集神經(jīng)科學(xué)、信息科學(xué)、計算機科學(xué)于一體的交叉邊緣學(xué)科，是生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) （Biology neural network）在結(jié)構(gòu)、功能及某些基本特性方面的理論抽象和模擬而構(gòu)成的一種信息處理系統(tǒng)[2，3]。本研究以Bacillus velezensis Z-27為發(fā)酵菌株，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合正交試驗法優(yōu)化其培養(yǎng)基發(fā)酵條件，旨在降低生產(chǎn)成本，為進一步研制具有抗腹瀉功能的豬用益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Bacillus velezensis Z-27菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，葡萄糖1.0%，NaH2PO4·2H2O 0.2%，Na2HPO4·2H2O 0.4%，CaCl2 0.02%，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗確定培養(yǎng)基組分 根據(jù)試驗需要單因素改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機鹽。搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，搖瓶裝液量50 mL，接種10～12 h芽孢桿菌Z-27菌株種子液，接種量2.0%，37 ℃培養(yǎng)24 h?？疾靻我蛩貙ρ挎邨U菌Z-27菌株發(fā)酵液活菌濃度、發(fā)酵液抗菌活性及芽孢產(chǎn)率的影響，從而得到最佳碳源、氮源和無機鹽。

利用發(fā)酵液梯度稀釋后涂布平板的活菌計數(shù)法測定芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵液活菌濃度。芽孢觀察和計數(shù)采用孔雀綠芽孢染色和血球計數(shù)板直接計數(shù)相結(jié)合的方法，將培養(yǎng)液稀釋一定倍數(shù)后在顯微鏡下觀察，計算芽孢產(chǎn)率。采用瓊脂打孔擴散法測定發(fā)酵液抗菌活性。

1.3.2 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基組成及接種量等培養(yǎng)條件對芽孢桿菌Z-27菌株發(fā)酵的影響按正交試驗表L16（45）進行考察[4-8]。碳源采用1.0%、2.0%、3.0%、4.0%四個水平；氮源采用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%四個水平；無機鹽采用0.01%、0.03%、0.05%、0.07%四個水平；pH采用6.5、7.0、7.5、8.0四個水平；接種量采用1.0%、2.0%、3.0%、4.0%四個水平。以發(fā)酵液活菌濃度為指標(biāo)，確定出芽孢桿菌Z-27菌株最佳培養(yǎng)基組成及最適接種量[9，10]。

1.3.3 芽孢桿菌Z-27菌株生長曲線的測定 在組成優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種齡為10～12 h的芽孢桿菌Z-27菌株種子液，搖床轉(zhuǎn)速170 r/min，搖瓶裝液量50 mL，接種量2.0%，37 ℃培養(yǎng)24 h。每隔2 h測定1次發(fā)酵液OD600 nm值，記錄測定時間及相應(yīng)OD600 nm值繪制芽孢桿菌Z-27菌株的生長曲線。

1.3.4 建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型 建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的圖形用戶界面：應(yīng)用Matlab7.2的GUIDE功能創(chuàng)設(shè)了含有輸入因子數(shù)據(jù)庫、輸出因子數(shù)據(jù)庫、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練參數(shù)設(shè)置、隱含層數(shù)、隱含層的神經(jīng)元數(shù)、訓(xùn)練函數(shù)、預(yù)測輸入、預(yù)測結(jié)果、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)保存等多個功能的操作界面。

數(shù)據(jù)輸入及網(wǎng)絡(luò)初始化：導(dǎo)入玉米粉、豆餅粉、MnSO4·H2O、pH、接種量5因素4水平的16個試驗值作樣本輸入，用專家相應(yīng)評價結(jié)果作為輸入樣本對應(yīng)的教師值，取精度ε=0.000 07，輸入節(jié)點數(shù)為5，隱含層取5個節(jié)點，輸出層取1個節(jié)點，以玉米粉、豆餅粉、MnSO4·H2O、pH、接種量 5因素為自變量，建立輸入矩陣，以活菌濃度為因變量，建立輸出矩陣，對數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)初始化。

網(wǎng)絡(luò)設(shè)置的訓(xùn)練參數(shù)為：最大訓(xùn)練步數(shù)為10 000，學(xué)習(xí)效率為0.02，訓(xùn)練誤差目標(biāo)為0，動量常數(shù)為0.05，網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練采用Levebberg-Marquardt算法。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.1.1 不同碳源對芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵的影響 在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入1.0%的不同碳源，進行發(fā)酵試驗，結(jié)果見表1。由表1可見，在培養(yǎng)基中以玉米粉和麩皮為碳源，活菌濃度均≥2.6×109 CFU/mL，芽孢產(chǎn)率亦均≥90%，發(fā)酵液中抑菌物對大腸桿菌的抑菌活性也較高。其中以玉米粉為碳源時，相應(yīng)的3個指標(biāo)均表現(xiàn)為最高，故選擇玉米粉為最佳碳源。

2.1.2 不同氮源對芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵的影響 以1.0%玉米粉為碳源，在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入1.0%的不同氮源進行發(fā)酵試驗，結(jié)果見表2。由表2可見，在培養(yǎng)基中以豆餅粉或花生餅粉為氮源，活菌濃度均≥2.40×109 CFU/mL，芽孢產(chǎn)率均≥97%，發(fā)酵液中抑菌物的活性也較高，因此豆餅粉或花生餅粉均可作為最佳氮源。以下試驗均選擇以豆餅粉為氮源。

2.1.3 不同無機鹽對芽孢桿菌Z-27菌株搖瓶發(fā)酵的影響 在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以1.0%玉米粉為碳源，以1.0%豆餅粉為氮源，分別添加FeSO4、ZnSO4、CuSO4·5H2O、CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O 6種無機鹽代替培養(yǎng)基中的CaCl2，添加量均為0.02%，考察不同無機離子對發(fā)酵的影響，不同無機離子對芽孢桿菌Z-27菌株活菌數(shù)、芽孢產(chǎn)率和抑制大腸桿菌能力的影響結(jié)果見表3。由表3可見，Mn2+對芽孢桿菌Z-27菌株的促進作用最強，故選擇MnSO4·H2O作為無機鹽。

2.1.4 正交試驗與結(jié)果 綜合以上各單因素試驗結(jié)果，選擇玉米粉、豆餅粉、MnSO4·H2O、pH、接種量 5個因素，按正交試驗表L16（45）設(shè)計試驗（表4），結(jié)果見表5。

依據(jù)正交試驗的直觀分析結(jié)果，極差值大小為R豆餅粉>RpH>R玉米粉>R接種量>R■，表明豆餅粉為主要影響因素，pH影響次之。由表5可見，7號試驗組合發(fā)酵液的活菌數(shù)最高，為1.70×109 CFU/mL，其組合為A2B3C4D1E2，即玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%，起始pH為6.5，接種量為2.0%。

2.2 對主要因素進行仿真和優(yōu)化分析

在正交試驗所獲得的較優(yōu)組合的基礎(chǔ)上，改變一種影響因素值，固定其他4種影響因素值，應(yīng)用所建立的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進行模擬，結(jié)果如圖1至圖5所示。

由圖1至圖5可知，固定其他4種影響因素值，改變一種影響因素值，所建立的BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進行數(shù)值仿真，確定獲得Bacillus velezensis Z-27菌株培養(yǎng)基組分為：玉米粉2.0%、豆餅粉1.5%、MnSO4·H2O 0.07%、起始pH為7.0、接種量為2.0%。應(yīng)用優(yōu)化得到的最佳組分進行了3次驗證試驗，所得活菌濃度平均為1.81×109 CFU/mL，優(yōu)于正交試驗結(jié)果。

3 小結(jié)與討論

1）利用正交試驗數(shù)據(jù)對BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進行訓(xùn)練，測試樣本的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和實際測量值的相對誤差小于1%，訓(xùn)練好的模型可對提取結(jié)果進行預(yù)測。

2）將BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)與傳統(tǒng)的正交試驗方法相結(jié)合，充分利用正交試驗數(shù)據(jù)，并對主要影響因素進行仿真優(yōu)化，獲得Bacillus velezensis Z-27菌株培養(yǎng)基組分：即玉米粉2.0%，豆餅粉1.5%，MnSO4·H2O 0.07%，起始pH為7.0，接種量為2.0%。

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