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    羽衣甘藍(lán)DH1代株系遺傳穩(wěn)定性分析

    2013-12-31 00:00:00戴希剛
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年13期

    摘要:以羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var. acephala)兩個(gè)自交系(F6代)作比較,利用ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測了羽衣甘藍(lán)3個(gè)DH1代株系的遺傳穩(wěn)定性,并對5個(gè)群體進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明,3個(gè)DH1代株系DN31、DP70、DT2和兩個(gè)自交系B62、B111利用9條ISSR引物分別擴(kuò)增出55、51、50、54和51條清晰條帶,其中,多態(tài)性位點(diǎn)DN31有3個(gè),DP70有2個(gè),DT2沒有,B62有19個(gè),B111有15個(gè)。羽衣甘藍(lán)DH1代株系內(nèi)基本不存在遺傳差異,基因型是純合的,兩個(gè)自交系遺傳穩(wěn)定性相對較差。表明小孢子培養(yǎng)技術(shù)在獲得純合體材料上比人工自交的方法高效、快捷,而且獲得的純系基因型更純、更穩(wěn)定。

    關(guān)鍵詞:羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var. acephala);DH系;ISSR標(biāo)記;遺傳穩(wěn)定性;聚類分析

    中圖分類號:S635.9;S503 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2013)13-3056-03

    利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)能快速獲得育種急需的遺傳穩(wěn)定材料和培育新的種質(zhì)資源,提高育種效率。小孢子培養(yǎng)所得植株加倍后獲得的雙單倍體構(gòu)成的群體稱為DH群體,從DH群體中篩選出來的株系叫DH系,DH系在遺傳上是完全純合的,可以直接作為優(yōu)良親本用于品種改良[1]??蒲泄ぷ髡卟捎眯℃咦优囵B(yǎng)技術(shù)已獲得一系列作物的優(yōu)良品系[2-4]。ISSR分子標(biāo)記具有DNA樣品用量少、操作簡單、信息量大、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn),且由于引物更長,退火溫度更高因而具有更好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性[5],是分析種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效工具。很多研究均成功地利用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析植物的遺傳變異性和遺傳關(guān)系[6-8]。

    羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var. acephala)是十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)甘藍(lán)種的一個(gè)變種,二年生草本植物,觀葉為主,由于耐寒性強(qiáng),觀賞期長,已成為我國廣大地區(qū)冬季及早春時(shí)節(jié)應(yīng)用最廣泛的觀賞植物之一[9]。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)開展羽衣甘藍(lán)育種工作,能快速獲得育種急需的遺傳穩(wěn)定材料,提高育種效率。小孢子植株DH系基因型理論上是完全純合的,而通過多代自交也可以達(dá)到此目的。為了比較小孢子培養(yǎng)技術(shù)和人工自交分別獲得純合體材料的效率,試驗(yàn)以羽衣甘藍(lán)兩個(gè)自交系作比較,利用ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測了羽衣甘藍(lán)3個(gè)基因型DH1代株系的遺傳穩(wěn)定性,并對5個(gè)株系進(jìn)行了聚類分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    羽衣甘藍(lán)3個(gè)基因型名古屋-紅、P3、東京-白的DH1代DN31、DP70和DT2,名古屋-紅和“K12”的自交系B62(F6代)和B111(F6代),材料來源及主要特征見表1。由羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)獲得的植株稱為DH0代,經(jīng)DH0代自交的自交一代稱為DH1代。

    1.2 方法

    1.2.1 DNA的提取 分別從供試材料各單株上取幼嫩葉片,參照王灝等[10]的方法,用稍作改良的CTAB小量法提取基因組DNA。

    1.2.2 ISSR擴(kuò)增 ISSR引物自行設(shè)計(jì),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL,其中10×Buffer 2 μL,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq DNA 聚合酶1 U,引物0.5 μmol/L,模板DNA 20 ng。 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性45 s,72 ℃延伸90 s,接著梯度降溫進(jìn)行復(fù)性,5個(gè)循環(huán)后穩(wěn)定在53 ℃復(fù)性,進(jìn)行38個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,擴(kuò)增產(chǎn)物在4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠(TAE電泳緩沖液,0.5 μg/L溴化乙錠)電泳檢測。在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照鑒定。

    1.2.3 數(shù)據(jù)分析 ISSR電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶,有帶記為1,無帶記為0。對原始矩陣用SimQual程序求Jaccard相似系數(shù)矩陣,并獲得相似系數(shù)矩陣。利用PopGene 32軟件計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(the number of polymorphic loci,N)、多態(tài)性位點(diǎn)比率(the percentage of polymorphic loci,P)、Shannon多樣性指數(shù)。用NTSYS-pc 2.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,將由“1”和“0”生成的原始矩陣用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析,最后通過Tree plot模塊生成聚類圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 羽衣甘藍(lán)DH1代株系ISSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性

    從38個(gè)ISSR引物中選取9個(gè)能夠獲得清晰條帶、反應(yīng)穩(wěn)定的ISSR引物(表2)。DN31、DP70、DT2每個(gè)株系各選取8株進(jìn)行ISSR標(biāo)記分析,結(jié)果表明,這3個(gè)DH1代株系9條ISSR引物分別擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性好的條帶55、51和50條(圖1),大小在200~1 500 bp,其中多態(tài)性位點(diǎn)DN31為3個(gè),DP70為2個(gè),DT2沒有,每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)在3~8條;3種材料的多態(tài)性位點(diǎn)比率分別為5.45%、3.92%和0,平均多樣性指數(shù)(I)分別為0.033 7、0.094 0和0 (表3),其中DT2沒有多態(tài)性位點(diǎn),說明它的各株系間完全沒有差異;從多態(tài)性位點(diǎn)比率和多樣性指數(shù)上可以看出,羽衣甘藍(lán)3個(gè)材料DH1代株系間基本無遺傳差異,說明由小孢子培養(yǎng)所得的植株經(jīng)過自交后的DH1代各株系基因型是純合的。

    同時(shí)也對兩個(gè)經(jīng)過6代自交的自交系材料(B62、B111)進(jìn)行了ISSR分析,結(jié)果表明,B62和B111的多態(tài)性位點(diǎn)比率分別為35.19%和29.41%,平均多樣性指數(shù)(I)分別為0.183 6和0.167 1(表3)。經(jīng)過6代自交的材料在遺傳上還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到純合,說明通過小孢子培養(yǎng)獲得純系相對于人工自交來說,不僅縮短了育種時(shí)間,也提高了效率,能在1~2年內(nèi)就獲得遺傳穩(wěn)定的純系。

    2.2 DH1代株系ISSR聚類分析

    對羽衣甘藍(lán)3個(gè)DH1代株系和2個(gè)自交系ISSR結(jié)果進(jìn)行聚類分析,結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,DH1代株系DN31、DP70、DT2的各株系間相似系數(shù)分別為0.97~1.00、0.98~1.00和1.00,說明這3個(gè)株系在遺傳上極其相似,表明它們在遺傳上是純合的,DN31、DP70株系內(nèi)略存在一些變異,這可能是自交過程中出現(xiàn)的稍許變異,在正常變異范圍內(nèi)。而兩個(gè)自交系B62和B111的相似系數(shù)范圍則相對大許多,分別為0.82~0.98和0.83~0.94,說明這兩個(gè)自交系內(nèi)各單株還存在一定程度的遺傳差異,基因型還沒有達(dá)到純合。再一次驗(yàn)證了DH1代比F6代自交系純合度高。

    3 小結(jié)與討論

    小孢子植株DH1代理論上其基因型是完全純合的,即DH1代株系內(nèi)各單株之間在遺傳組成上完全相同,不存在差異。通過ISSR標(biāo)記分析了羽衣甘藍(lán)3個(gè)DH1代株系內(nèi)的遺傳多樣性,并以F6代自交系作為對比,結(jié)果發(fā)現(xiàn),3個(gè)DH1代株系內(nèi)的遺傳多樣性都極小,其相似系數(shù)均接近于1,其中DH1代株系DT2各單株間完全沒有差異,遺傳相似系數(shù)為1.0;在DH1代株系DN31和DP70中存在較小的差異,可能是由于ISSR分析過程中存在某些誤差,或者是種植于大田中受到環(huán)境因素的影響發(fā)生的稍許變異??傮w來講,羽衣甘藍(lán)的DH1代株系內(nèi)基本不存在遺傳差異,基因型是純合的。被試的兩個(gè)自交系的遺傳多樣性則相對大得多,說明自交6代的自交系其在遺傳上遠(yuǎn)未達(dá)到純合,因此羽衣甘藍(lán)要想通過人工自交的手段獲得純系,自交6代還遠(yuǎn)不夠,估計(jì)至少要自交8~10代。這也證實(shí)了小孢子培養(yǎng)技術(shù)在獲得純合體材料上比人工自交的方法更高效、快捷,而且獲得的純系在基因型上更純、更穩(wěn)定。

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