一株產(chǎn)黑色素海洋細(xì)菌的初步鑒定

摘要：從波羅的海近海海水中分離出1株產(chǎn)黑色素的海洋細(xì)菌。該菌株可利用麥芽糖、蔗糖、葡萄糖等碳源，H2S、V.P. 及明膠液化試驗(yàn)呈陰性，酶觸試驗(yàn)呈陽(yáng)性，為革蘭氏陰性細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA初步鑒定后命名為Rheinheimera sp. 09BSZB-9，并對(duì)其產(chǎn)生的黑色素作了初步研究。

關(guān)鍵詞：海洋細(xì)菌；黑色素；鑒定；Rheinheimera

中圖分類(lèi)號(hào)：Q93-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-3046-03

黑色素廣泛存在于自然界生物體內(nèi)，是一類(lèi)由L-多巴、酪氨酸和半胱氨酸氧化或聚合而成的天然或合成色素[1]。它是醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及化妝品行業(yè)的一種生產(chǎn)原料。從動(dòng)植物體內(nèi)提取黑色素的生產(chǎn)過(guò)程繁瑣、成本高，而微生物所產(chǎn)的黑色素一般是由胞內(nèi)酶催化形成的氨基酸的衍生物。產(chǎn)黑色素的微生物資源豐富，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單易行，產(chǎn)品無(wú)毒害，穩(wěn)定性好。因此研究微生物發(fā)酵產(chǎn)生黑色素具有很大的優(yōu)勢(shì)[2-4]。人們對(duì)陸境產(chǎn)黑色素的微生物研究較多，對(duì)海洋中產(chǎn)黑色素的微生物報(bào)道較少。本試驗(yàn)研究從波羅的海分離的一株著色菌科細(xì)菌，該菌具有產(chǎn)黑色素的能力，在生理生化特征及16S rDNA序列等方面與Rheinheimera chironomi相近，以期為海洋微生物黑色素研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源 菌株ZB-9由本實(shí)驗(yàn)室的劉斌分離于波羅的海（E12.687 5°，N54.429 8°）海水。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA Marker、dNTPs、Taq酶等購(gòu)自Takara公司；PCR純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；Biometre公司PCR擴(kuò)增儀（T3）；Eppendorf公司微型臺(tái)式離心機(jī)；日本JEOL公司JEM-1230透射式電鏡；德國(guó)Bruker公司TENSOR 27型紅外光譜儀。

1.1.3 培養(yǎng)基 2216E細(xì)菌培養(yǎng)基、Tyr發(fā)酵培養(yǎng)基[5]、酪素培養(yǎng)基[6]、LB培養(yǎng)基均按人工海水和蒸餾水各半配制，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7、8]對(duì)菌株ZB-9進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

1.2.2 形態(tài)特征觀察及發(fā)酵 將菌株ZB-9接種于LB培養(yǎng)基，24 ℃培養(yǎng)2 d，利用顯微鏡及透射電鏡觀察菌體形態(tài)并拍照。將菌株涂布于221 6E平板，24 ℃活化2 d，轉(zhuǎn)接試管培養(yǎng)2 d，再將菌液接種于1.1.3的4種液體培養(yǎng)基中，24 ℃，150 r/min搖瓶培養(yǎng)至菌液呈黑色。

1.2.3 16S rDNA序列分析 細(xì)菌基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[9]的方法。PCR擴(kuò)增的通用引物：27F，1492R；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，試劑盒純化后，送交上海博亞生物技術(shù)有限公司完成序列測(cè)定。所測(cè)得的序列提交至GenBank，獲得登錄號(hào)，并與數(shù)據(jù)庫(kù)EzTaxon Server Version 2.1中已有序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，選取同源性較高的16S rDNA序列作為參比對(duì)象，運(yùn)用DNAMAN進(jìn)行多重序列分析，通過(guò)MEGA 4.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[10]。

1.2.4 黑色素的提取與鑒定 參照文獻(xiàn)[11、12]方法提取黑色素；取少量提取的黑色素純品，用溴化鉀壓片法測(cè)其紅外吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生理生化特征

挑新鮮菌落于3%的KOH中出現(xiàn)拉絲現(xiàn)象，為革蘭氏陰性菌，H2S、V. P.及明膠液化試驗(yàn)呈陰性，酶觸試驗(yàn)呈陽(yáng)性，銅離子（0.1 g/L）會(huì)抑制其生長(zhǎng)。對(duì)麥芽糖、蔗糖及纖維二糖利用較好，不能利用淀粉、檸檬酸（表1）。菌株在酪氨酸培養(yǎng)基上適宜生長(zhǎng)溫度為4～40 ℃。菌落較小，濕潤(rùn)、光滑、圓形突起、邊緣整齊，菌體之間粘連成團(tuán)，易挑取整個(gè)菌落，呈黑色（起初白色，產(chǎn)黑色素后呈黑色，圖1）。

2.2 菌株的形態(tài)及發(fā)酵特性

菌體寬0.8～1.4 μm，長(zhǎng)0.8～2.4 μm，電鏡下菌體周?chē)蟹置谖?，單端鞭毛（圖2）。菌株在4種液體培養(yǎng)基中均產(chǎn)生黑色素，其中較好的是Tyr發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.3 菌株的鑒定結(jié)果

該菌株的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 358 bp，GenBank登錄號(hào)為HM566014。將該序列與數(shù)據(jù)庫(kù)EzTaxon Server Version 2.1相關(guān)序列進(jìn)行BLAST分析，選取同源性高的9株菌的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示，該菌株與R. chironomi處于進(jìn)化樹(shù)的同一分支，同源性99.853%，與R. pacifica的同源性97.035%。除產(chǎn)黑色素同R. chironomi有別外，其他生理生化及形態(tài)特征差別不大。

2.4 黑色素的鑒定結(jié)果

紅外光譜分析表明，樣品在3 300～3 400 cm-1、1 640 cm-1附近有強(qiáng)吸收峰，在1 382 cm-1、1 450～1 600 cm-1、2 900 cm-1附近有弱吸收峰；1 238 cm-1附近有中強(qiáng)吸收峰（圖4）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道3 300 cm-1處的吸收峰是因?yàn)?OH、-NH2的伸展振動(dòng)引起，1 643 cm-1處吸收峰主要是C=C、-COO-、C=O伸展振動(dòng)引起，與文獻(xiàn)[13]的紅外光譜圖相似，說(shuō)明其主要功能團(tuán)基本一致。

3 討論

在菌株的培養(yǎng)特征、生理生化特征和細(xì)胞特征的基礎(chǔ)上，結(jié)合16S rDNA序列分析結(jié)果，菌株ZB-9與R. chironomi[14]比較相似，而與R. pacifica差別很大（表1）。暫命名為Rheinheimera sp. 09BSZB-9。

該研究首次發(fā)現(xiàn)色菌科細(xì)菌可產(chǎn)黑色素，在酪氨酸存在的條件下黑色素產(chǎn)量較好。黑色素越來(lái)越受到人們的青睞，與從動(dòng)植物中提取的方式相比，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)黑色素具有快速、簡(jiǎn)便、易提取等特點(diǎn)，且細(xì)菌、放線(xiàn)菌產(chǎn)生的黑色素可分泌到胞外，無(wú)需破碎細(xì)胞，便于提取。下一步將對(duì)ZB-9產(chǎn)黑色素的發(fā)酵條件做細(xì)化研究，為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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