姜的脫毒方法比較與繁殖生根同步化培養(yǎng)技術(shù)研究

摘要：考察了莖尖大小、熱處理催芽結(jié)合莖尖培養(yǎng)以及催芽后高溫?zé)崽幚斫Y(jié)合莖尖培養(yǎng)等對(duì)姜（Zingiber officinale Rosc.）莖尖培養(yǎng)脫毒效果影響，并進(jìn)行了脫毒姜試管苗的繁殖生根同步化培養(yǎng)基篩選。結(jié)果表明，0.3 mm的莖尖能夠獲得較為理想的成活率、成苗率，并且具有較好的脫毒效果；熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)能夠提高脫毒效果，且催芽后高溫短時(shí)間熱處理的脫毒效果優(yōu)于熱處理直接催芽；確定脫毒姜繁殖生根同步化培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+2.50 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.2～0.3 mg/L ABT，在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的試管苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛，根系發(fā)達(dá)，移栽成活率高。

關(guān)鍵詞：姜（Zingiber officinale Rosc.）；脫毒方法；分生組織培養(yǎng)；同步化培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S632.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）18-4522-04

姜（Zingiber officinale Rosc.）屬姜科姜屬（Zingiber）為多年生宿根草本植物，其新鮮根莖既是日常餐桌上重要的調(diào)味品、保健品，也是常用的中藥材，為典型的藥食兩用經(jīng)濟(jì)作物。生姜味辛、性微溫，歸肺、脾、胃經(jīng)，具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳的功效，常用于治療感冒風(fēng)寒、嘔吐、痰飲、喘咳、脹滿、泄瀉等，解半夏、天南星、魚蟹及鳥獸肉之毒[1]。

姜為無性繁殖作物，在長(zhǎng)期的栽培過程中會(huì)受到多種病毒的侵染，并且不斷地在體內(nèi)積累。研究表明侵染姜的病毒主要為黃瓜花葉病毒（CMV）和煙草花葉病毒（TMV）[2，3]。病毒與姜競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)成分，使姜出現(xiàn)局部或系統(tǒng)花葉褪綠、植株矮化或葉畸形等癥狀，從而導(dǎo)致姜產(chǎn)量降低30%，嚴(yán)重者可減產(chǎn)45%以上，且品質(zhì)和抗性也會(huì)受到不同程度的影響[4]。

目前，姜的無毒苗獲得方法主要有熱處理法和莖尖培養(yǎng)法。熱處理法需要在高溫、高濕環(huán)境中保存較長(zhǎng)時(shí)間，且處理后的無毒苗較為疲軟，在組培接種時(shí)表面消毒不易徹底，目前基本上不單獨(dú)使用。近年來，使用莖尖培養(yǎng)對(duì)姜脫病毒的研究報(bào)道較多，但使用熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)法進(jìn)行姜脫病毒的系統(tǒng)性研究報(bào)道較少。本研究對(duì)姜進(jìn)行改良熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)，考察了莖尖大小、熱處理催芽后結(jié)合莖尖培養(yǎng)及催芽后熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)的脫毒效果，并建立了脫毒姜試管苗的繁殖生根同步化組織培養(yǎng)體系，為脫毒姜苗的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

姜為采自山東省萊蕪市生姜產(chǎn)區(qū)的萊蕪大姜，植株的健康根莖儲(chǔ)藏至中國(guó)藥科大學(xué)遺傳育種教研室，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)遺傳育種教研室高山林教授復(fù)核為姜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莖尖大小對(duì)脫毒效果影響的考察 將萊蕪大姜的姜塊用經(jīng)50%多菌靈800倍液浸泡處理的細(xì)沙鋪底和覆蓋，在室溫（25 ℃）下催芽，待芽長(zhǎng)至0.5～1.0 cm時(shí)，洗潔精清洗5 min，剝?nèi)ネ鈱尤~子在自來水下沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上，用0.1%升汞溶液（加2～3滴吐溫-20）消毒8～10 min，無菌水沖洗3～5次。解剖鏡下剝?nèi)в?個(gè)約0.4～0.5 mm葉原基、約2個(gè)0.3 mm 葉原基、約1個(gè)0.2 mm 葉原基和不帶葉原基的莖尖分生組織接種到MS+2.00 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d。每瓶接種3個(gè)莖尖，每個(gè)處理接種10瓶。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照度1 500 lx，光照時(shí)間14～16 h/d。計(jì)算成活率、成苗率，并在電鏡下觀察脫毒效果。

1.2.2 熱處理催芽結(jié)合莖尖培養(yǎng)對(duì)脫毒效果影響的考察 根據(jù)莖尖培養(yǎng)的結(jié)果，取萊蕪大姜的姜塊，用經(jīng)50%多菌靈800倍液浸泡處理的細(xì)沙鋪底和覆蓋，于36、40、44 ℃下催芽[5，6]，待芽長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，切下1～2 cm的莖尖，按照莖尖剝?nèi)》椒▌兿录s0.3 mm的莖尖分生點(diǎn)接種在MS+2.00 mg/L 6-BA +0.2 mg/L IAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d。每瓶接種3個(gè)莖尖，每個(gè)處理接種10瓶，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。計(jì)算成活率、成苗率，并在電鏡下觀察脫毒效果。

1.2.3 催芽后高溫?zé)崽幚斫Y(jié)合莖尖培養(yǎng)對(duì)脫毒效果影響的考察 取萊蕪大姜的姜塊，用經(jīng)50%多菌靈800倍液浸泡處理的細(xì)沙鋪底和覆蓋，在室溫（25 ℃）下催芽，待芽長(zhǎng)至0.5～1.0 cm時(shí)，洗潔精水清洗5 min，剝?nèi)ネ鈱尤~子在自來水下沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上，用0.1%升汞溶液（加2～3滴吐溫 -20）消毒8～10 min，無菌水沖洗3～5次。置于60 ℃的高溫下分別處理15、30、45、60和75 min，再在無菌條件下切取約0.3 mm的莖尖分生點(diǎn)接種在MS+2.00 mg/L 6-BA +0.2 mg/L IAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d。每瓶接種3個(gè)莖尖，每個(gè)處理接種10瓶，培養(yǎng)條件同“1.2.1”。計(jì)算成活率、成苗率，并在電鏡下觀察脫毒效果。

1.2.4 脫毒效果鑒定 取脫毒處理后繁殖獲得的叢生芽嫩葉，在低溫下（-18 ℃）冷凍1 h，加1.5倍體積的0.1 mmol/L PBS（含2.5% 戊二醇，10%氯仿，pH 7.4）攪碎，勻漿2 min，雙層紗布過濾，濾液加10% 正丁醇，再勻漿1～2 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min。上清液加入6% PEG 6000和0.1 mmol/L NaCl充分溶解，10 000 r/min離心20 min。沉淀用0.2 mmol/L PBS 懸浮至4.0～6.0 mL。用細(xì)滴管吸取懸液，滴在載網(wǎng)上，2 min后吸取多余液體，加1滴（約10 μL）2% 磷鎢酸（pH 6.8）負(fù)染色2 min，室溫干燥后，電鏡（HITACH-7000）下觀察。每個(gè)樣品做3個(gè)銅網(wǎng)，每個(gè)銅網(wǎng)至少取20個(gè)不同視野檢測(cè)病毒，并與文獻(xiàn)[2]報(bào)道相對(duì)照，觀察脫毒效果。

1.2.5 繁殖生根同步化培養(yǎng)基篩選 將電鏡檢測(cè)后獲得的脫毒苗接種到培養(yǎng)基上擴(kuò)繁后，以6-BA、NAA、ABT 3種激素的3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)L9（33），篩選脫毒姜的繁殖生根同步化培養(yǎng)基。每個(gè)處理10瓶，每瓶3個(gè)單芽，30 d后測(cè)試管苗平均生長(zhǎng)率和芽增殖倍數(shù)，以平均生長(zhǎng)率、芽增殖倍數(shù)和單株生根率為主要考察指標(biāo)來篩選同步化培養(yǎng)基。平均生長(zhǎng)率=（30 d后材料重-接種時(shí)材料重）/接種時(shí)材料重；芽增殖倍數(shù)=（30 d后芽數(shù)-接種時(shí)芽數(shù)）/接種時(shí)芽數(shù)。試驗(yàn)因素水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖大小對(duì)脫毒效果的影響

病毒在植物體內(nèi)通過維管組織遷移，由于分生組織尚未形成維管組織，一般不含病毒或只含少量病毒。因此，通過莖尖分生組織培養(yǎng)可以獲得無毒的姜試管苗（圖1）。莖尖大小對(duì)成活率、成苗率和脫毒率的影響結(jié)果見表2。從表2中可以看出，莖尖大小對(duì)成活率、成苗率和脫毒率均有影響。接種的莖尖越小，莖尖的成活率越低，但所獲得小苗的脫毒率卻越高，如莖尖大小為0.1 mm的處理組獲得的2株成活苗在電鏡下均未觀察到病毒粒子。但莖尖越小，培養(yǎng)后獲得的存活苗數(shù)也越少，且成活的莖尖不能分化，重新形成完整幼苗的可能性也越小。綜合上述各項(xiàng)因素，0.3 mm的莖尖能夠獲得較為理想的成活率、成苗率，并且具有較好的脫毒效果。

2.2 熱處理催芽結(jié)合莖尖培養(yǎng)對(duì)脫毒效果影響

熱處理催芽并結(jié)合莖尖培養(yǎng)對(duì)脫毒效果的影響見表3。由表3可知，與室溫催芽相比較，熱催芽處理對(duì)莖尖分生組織的成活率和成苗率的影響并不明顯，但熱催芽處理獲得的脫毒率高于對(duì)照組。較高的催芽溫度也會(huì)影響接種莖尖再生植株的能力，44 ℃處理組成活莖尖與莖尖成苗數(shù)量均低于另外2個(gè)熱處理組，且熱處理催發(fā)的芽一般顏色發(fā)白，芽的質(zhì)量有所下降。

2.3 高溫?zé)崽幚斫Y(jié)合莖尖培養(yǎng)對(duì)脫毒效果的影響

侵染姜的主要病毒為煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒。煙草花葉病毒是桿狀病毒，在90～93 ℃的高溫下處理10 min可將該病毒鈍化，但是這一溫度對(duì)細(xì)胞的殺傷力也比較大，一般植物細(xì)胞無法耐受如此高的溫度，因此在熱處理時(shí)一般不會(huì)采用這一溫度。黃瓜花葉病毒是一種球狀病毒，鈍化溫度為60～70 ℃，在此溫度下處理10 min即可將病毒鈍化，且短時(shí)間暴露在此溫度中不會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成過大的傷害，因此，本試驗(yàn)中采用60 ℃作為高溫?zé)崽幚淼臏囟取?/p>

高溫?zé)崽幚斫Y(jié)合莖尖培養(yǎng)法對(duì)成活率、成苗率和脫毒率的影響結(jié)果見表4。從表4可以看出，隨著熱處理的時(shí)間的增加，接種莖尖的成活率下降，表明暴露在高溫中的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞的存活能力越弱。雖然隨著高溫處理時(shí)間的增加，獲得的成苗數(shù)量下降，但成活苗的脫毒率上升，表明高溫鈍化部分病毒有助于提高脫毒效果。雖然高溫處理可以將部分病毒鈍化，但是高溫處理的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般在15～30 min為宜，高溫可使部分植物細(xì)胞死亡，甚至使剝?nèi)〉那o尖無法成活。高溫處理的時(shí)間越長(zhǎng)，莖尖死亡的數(shù)量也越多，能夠獲得的重生苗數(shù)量也越少，導(dǎo)致處理組的總體脫毒率下降。

2.4 繁殖生根同步化培養(yǎng)基篩選結(jié)果

脫病毒試管苗的繁殖生根同步化培養(yǎng)基篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。平均生長(zhǎng)率結(jié)果表明，3種因素對(duì)平均生長(zhǎng)率的影響順序是B（NAA）、A（6-BA）、C（ABT），其中NAA對(duì)平均生長(zhǎng)率具有顯著影響，6-BA和ABT的影響較小。以平均生長(zhǎng)率為指標(biāo)篩選出的最佳培養(yǎng)基A3B3C3，即MS+2.50 mg/L 6-BA + 0.4 mg/L NAA +0.3 mg/L ABT。芽增殖倍數(shù)結(jié)果表明，3種因素對(duì)芽增殖倍數(shù)的影響順序是A（6-BA）、B（NAA）、C（ABT），其中6-BA對(duì)芽增殖倍數(shù)具有顯著影響，NAA對(duì)芽增殖倍數(shù)有影響，而ABT對(duì)芽的增殖影響不大。以芽增殖倍數(shù)為指標(biāo)篩選出的最佳培養(yǎng)基為A3B3C2，即MS+2.50 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA +0.2 mg/L ABT。單株生根率結(jié)果表明，3種因素對(duì)單株生根率的影響順序是B（NAA）、C（ABT）、A（6-BA），但3種因素的影響均不顯著。以單株生根率為指標(biāo)篩選出的最佳培養(yǎng)基為A3B3C3，即MS+2.50 mg/L 6-BA +0.4 mg/L NAA +0.3 mg/L ABT。

綜合以上因素，確定脫毒姜試管苗繁殖與同步化的適合培養(yǎng)基為MS+2.50 mg/L 6-BA +0.4 mg/L NAA+0.2～0.3 mg/L ABT。在繁殖生根同步化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的姜試管苗比較粗壯，株高較高，葉片顏色較深，根系發(fā)達(dá)，適合直接移栽苗床。接種到正交試驗(yàn)中9種培養(yǎng)基的試管苗均能獲得大量的叢生芽，且未分離成單株小苗前，各叢生芽束均長(zhǎng)出根（圖2）。

3 小結(jié)與討論

植物病毒在體內(nèi)是通過維管束系統(tǒng)和胞間連絲進(jìn)行遷移的，而最主要的遷移途徑就是植物體內(nèi)的維管系統(tǒng)，因?yàn)榉稚M織內(nèi)沒有維管系統(tǒng)，病毒只能依靠胞間連絲進(jìn)行移動(dòng)，速度非常慢，難以追上分生組織活躍的生長(zhǎng)速度，所以植物的莖尖分生組織一般沒有病毒或僅有少量病毒分布。而在莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒的過程中，莖尖大小是影響植物脫毒是否成功的一個(gè)重要因素，因?yàn)榍o尖過大，雖然容易培養(yǎng)獲得小苗，但病毒不易除去，無法達(dá)到脫毒的效果；而莖尖越小，病毒越容易除去，但越不易培養(yǎng)成活，也無法獲得無毒苗，影響脫毒效果[7]。

本研究中比較兩種熱處理法對(duì)脫毒效果的影響，發(fā)現(xiàn)采用熱處理法進(jìn)行催芽時(shí)，熱處理對(duì)芽的傷害較小，芽的成活率和成苗率均高于高溫短時(shí)熱處理法。這是因?yàn)闊崽幚泶哐渴窃跓崽幚砗蟛胚x取健壯芽點(diǎn)，熱處理對(duì)芽的傷害作用在嫩芽選取時(shí)已經(jīng)消除，而高溫短時(shí)熱處理是在對(duì)嫩芽消毒后進(jìn)行，熱處理可能對(duì)芽造成殺傷作用或降低了芽尖的生命力，從而使得芽的成活率和成苗率均有所降低。但熱處理催芽所需時(shí)間較長(zhǎng)，溫度保持對(duì)設(shè)施的要求較高、所需的經(jīng)濟(jì)成本也較大，而高溫?zé)崽幚淼臅r(shí)間較短，經(jīng)濟(jì)成本相應(yīng)降低，且在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行熱處理獲得的脫毒效果也比較理想。因此，綜合考慮植物體內(nèi)病毒的特性，采用短時(shí)間的高溫處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)進(jìn)行姜脫毒是較為理想的方法。

適合的姜脫毒苗同步化培養(yǎng)可以縮短培養(yǎng)周期，節(jié)省人力、物力，同時(shí)可獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的適合移栽的脫毒試管苗。與繁殖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的叢生芽相比較，同步化培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的試管苗比較粗壯，株高較高，葉片顏色較深，根系發(fā)達(dá)，適合直接移栽苗床。接種到正交試驗(yàn)中9種培養(yǎng)基的試管苗均能獲得大量的叢生芽，且未分離成單株小苗前，各叢生芽束均長(zhǎng)出根。在較高濃度的NAA和ABT組合時(shí)，根的數(shù)量較多，根長(zhǎng)較為適中，根生長(zhǎng)狀況良好，根系發(fā)達(dá)，分成單株后每株小苗平均有2～3個(gè)根，且根的長(zhǎng)度約在3～4 cm，移栽苗床可以獲得較高的成活率，為脫毒姜苗的生產(chǎn)推廣提供技術(shù)依據(jù)。

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