進境辣椒中低齡辣椒實蠅幼蟲的鑒定

摘要：自菲律賓進境旅客攜帶的小紅辣椒中截獲1頭低齡實蠅幼蟲。分別用辣椒實蠅（Bactrocera lati-frons）、橘小實蠅（B. dorsalis）和地中海實蠅（Ceratitis capitata）的特異性引物lati1/lati2、PF-1/PF-2和CCCA-COL-L/CCCA-COL-R對樣品總DNA進行PCR擴增和測序后，與Genbank中已知序列比對，結果表明該實蠅與Genbank中辣椒實蠅（FJ903498.1）的同源性達99%。結合形態(tài)學特征，確認截獲的樣本為辣椒實蠅（Bactrocera latifrons）。

關鍵詞：辣椒實蠅（Bactrocera latifrons）；低齡幼蟲；形態(tài)學鑒定；分子生物學鑒定

中圖分類號：S41-30 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4385-03

辣椒實蠅（Bactrocera latifrons）、橘小實蠅（B. dorsalis）和地中海實蠅（Ceratitis capitata）屬雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritidae），其中辣椒實蠅和橘小實蠅屬果實蠅屬（Bactrocera），主要分布在東南亞地區(qū)；地中海實蠅屬小條實蠅屬（Ceratitis），原產西非，現(xiàn)已隨果蔬傳播到90多個國家和地區(qū)[1]。這3種害蟲的形態(tài)和寄主都十分相似，可為害多種水果和蔬菜，主要以幼蟲寄生在果實內造成危害。此3種昆蟲均為國際上關注的具有重要經(jīng)濟意義的害蟲，中國已將其列為進境植物檢疫性有害生物[2]。近年來，中國口岸經(jīng)常從泰國、菲律賓、越南等東南亞地區(qū)進境的水果和蔬菜中截獲這3種害蟲[3-8]，因此，這類害蟲隨進境果蔬傳入中國的風險極大，嚴重威脅中國農業(yè)生產安全，應加強入境果蔬的檢疫查驗，防止此類有害生物的傳入。2011年7月18日，重慶出入境檢驗檢疫局在對從菲律賓入境旅客攜帶的紅辣椒實施檢疫的過程中，截獲了一頭實蠅幼蟲，由于該蟲仍處于低齡階段，難以通過形態(tài)學準確鑒定，所以應用分子生物學方法對其進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

2011年7月18日在從菲律賓進境旅客攜帶的紅辣椒中截獲1頭實蠅幼蟲，樣品儲存于75%乙醇中。對照樣品為實驗室保存的東南亞進境果蔬中常見的辣椒實蠅、橘小實蠅和地中海實蠅樣本。

1.2 形態(tài)觀察

將幼蟲樣本放在Nikon SMZ800體視顯微鏡下進行形態(tài)特征觀察并拍照。

1.3 基因組DNA提取

使用DNeasy Tissue Kit（Qiagen，Germany）試劑盒提取DNA。保存于-20 ℃冰箱中。

1.4 PCR擴增

參照文獻[9，10]，采用辣椒實蠅、橘小實蠅和地中海實蠅的特異性引物lati1/lati2、PF-1/PF-2和CCCA-COL-L/CCCA-COL-R[生工生物工程（上海）股份有限公司]；PCR反應體系： 10×PCR buffer 2.5 μL、MgCl2（2 mmol/L）2.5 μL、dNTPs（0.2 mmol/L）2 μL、引物各1 μL（0.2 mmol/L）、Taq DNA polymerase 0.2 U、模板DNA 3 μL、ddH2O 13.8 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取3 μL PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照觀察。

1.5 PCR產物測序及比對

將擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，測序結果經(jīng)軟件比對后進行校對和拼接。拼接完成后與GenBank中已發(fā)布的DNA序列進行比對，確定其種類。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)描述

幼蟲蛆式，體長約2.5 mm，體乳白色透明，12節(jié)，腹部每節(jié)腹面的紡錘區(qū)有小刺（圖1a）；頭咽骨片末端的附屬片以紡錘形裂口與咽骨角相分離，口針有1端前齒，舌懸骨甚長；前氣門突起呈黃褐色，形狀類似扇形，指突15～17個（圖1b）；后氣門具3個氣門裂，被骨化板所圍繞，周圍具4叢毛群（圖1c）。

2.2 分子生物學鑒定結果

分別用引物lati1/lati2、PF-1/PF-2、CCCA-COL-L/CCCA-COL-R擴增截獲樣品的總DNA，并與相應陽性對照作比較。結果顯示，僅辣椒實蠅特異性引物lati1/lati2產生擴增反應，得到約330 bp的PCR產物，且與陽性對照序列長度一致（圖2a），橘小實蠅、地中海實蠅特異性引物均未產生擴增反應（圖2b，圖2c）。PCR測序后經(jīng)校對和拼接，得到一條321 bp的序列（圖3），將其與GenBank中已發(fā)布的DNA序列進行比對。結果表明，該截獲樣本與辣椒實蠅（登錄號為FJ903498.1）的序列同源性高達99%，結合形態(tài)學鑒定結果確認該幼蟲為辣椒實蠅。向GenBank提交了該序列，登錄號為JQ345524。

3 討論

在口岸檢疫過程中，通常截獲的實蠅為幼蟲，而實蠅的常規(guī)鑒定主要以成蟲形態(tài)特征為依據(jù)。常規(guī)鑒定方法是將幼蟲培養(yǎng)到成蟲再進行鑒定，整個檢疫鑒定過程長達數(shù)周，并要求鑒定者具有豐富的經(jīng)驗[11]。當截獲的樣本太小，且不能被飼養(yǎng)為成蟲時，常規(guī)鑒定方法很難完成鑒定任務。因此，實蠅的快速、準確鑒定就成為植物檢疫工作中的一個技術問題。而采用分子生物學方法就可不進行飼養(yǎng)，在短時間內鑒定出幼蟲種類，因此分子生物學方法是一項很好的對幼蟲進行種類鑒定的技術手段，生物條形碼技術也日臻成熟，與形態(tài)學鑒定相結合，應用前景十分廣闊。

辣椒實蠅主要以幼蟲寄生在被害果實內，隨寄主果實作遠距離傳播，具有很強的隱蔽性，這是該蟲主要的傳播途徑之一。一旦口岸漏檢，該蟲隨被寄生的水果入境，就極易引起嚴重的擴散和危害。因此，加強口岸果蔬檢疫是防止辣椒實蠅入侵的重要手段和措施，對從該蟲發(fā)生區(qū)輸入的鮮果及入境旅客攜帶的水果，特別是易感寄主果蔬，必須實施嚴格的檢疫，作為辣椒主產區(qū)的渝、黔、湘、桂等地，更應加強相應檢疫能力建設。

參考文獻：

[1] 梁廣勤，姚文廣.地中海實蠅[M].北京：中國農業(yè)出版社，1998.

[2] 中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄[EB/OL].農業(yè)部公告，2007-05-29[2012-10-13].http：//www.moa.gov.cn/sjzz/zzj/zcfgzzj/gfxwj/201112/t20111206_2424113.htm.

[3] 李 萍. 東興局多次在越南水果中截獲桔小實蠅[J].植物檢疫，2001，15（3）：137.

[4] 王振華，李金甫，趙 暉，等. 湖北口岸截獲辣椒實蠅[J].植物檢疫，2008，22（5）：309.

[5] 黃迎波. 黃花機場桔小實蠅截獲特征及檢疫對策[J].湖南農業(yè)科學，2008，（2）：106-107.

[6] 黃 箭，黃法余. 南?？诎督孬@地中海實蠅[J].植物檢疫，1999，13（5）：301.

[7] 林何燕，張士才，閻 升. 南通口岸截獲桔小實蠅[J].植物檢疫，2004，18（2）：87.

[8] 王 伍，韓長錄，羅思云. 深圳羅湖口岸從旅客攜帶的番荔枝中截獲地中海實蠅[J].植物檢疫，2000，14（2）：128.

[9] 余道堅，章桂明，陳志粦，等.SYBR Green 實時熒光PCR 快速鑒定辣椒實蠅[J].植物檢疫，2006，20（1）：10-14.

[10] 孔秋蓮，葉 軍，岳 玲，等. 快速檢測水果中桔小實蠅卵的分子診斷方法研究[J].華北農學報，2010，25（1）：226-230.

[11] 余道堅.檢疫性實蠅分子生物學快速鑒定技術的研究[D].上海：中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所，2005.