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    NaOH預(yù)處理小麥秸稈對(duì)纖維素酶水解的影響

    2013-12-31 00:00:00馬海元等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2013年18期

    摘要:以小麥秸稈為底物,對(duì)不同NaOH預(yù)處理?xiàng)l件下小麥秸稈的纖維素酶水解效率進(jìn)行了研究,考察因子包括NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、小麥秸稈固體含量、預(yù)處理時(shí)間,同時(shí)利用掃描電子顯微鏡(SEM)分析了酶水解過(guò)程中小麥秸稈的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明,在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%、小麥秸稈固體含量為0.050 g/mL、預(yù)處理時(shí)間為60 min時(shí),小麥秸稈的糖化效率最高,總還原糖的產(chǎn)率達(dá)到86.61%,較未處理時(shí)產(chǎn)率提升74.60個(gè)百分點(diǎn)。利用最佳預(yù)處理?xiàng)l件下的小麥秸稈進(jìn)行同步糖化發(fā)酵,其乙醇產(chǎn)率達(dá)到71.70%,較未處理時(shí)產(chǎn)率提升49.30個(gè)百分點(diǎn)。

    關(guān)鍵詞:小麥秸稈;糖化發(fā)酵;NaOH預(yù)處理

    中圖分類(lèi)號(hào):TQ353 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2013)18-4355-04

    第二代生物質(zhì)乙醇是利用不同的原料如木材、農(nóng)業(yè)或者森林廢棄物來(lái)生產(chǎn),纖維素乙醇作為一種重要的可再生能源,具有能夠支撐全球能源消耗20%~100%的潛力。在纖維素乙醇的生產(chǎn)過(guò)程中非常重要的一步就是將半纖維素和纖維素水解為單糖,目前最具發(fā)展前景的水解方法為纖維素酶水解。為了使纖維素酶能夠與纖維素有效接觸,需要在水解之前對(duì)木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理,解除木質(zhì)素、半纖維素等對(duì)纖維素的保護(hù)作用,同時(shí)破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu),增加其比表面積[1],從而提高纖維素的水解糖化效率。

    NaOH溶液的潤(rùn)漲處理是發(fā)現(xiàn)最早、應(yīng)用最廣的預(yù)處理手段之一,其處理溫度和壓力都低于其他預(yù)處理手段[2]。NaOH預(yù)處理打開(kāi)了交聯(lián)木質(zhì)素和木聚糖的酯鍵,能夠部分溶解原料中的木質(zhì)素、半纖維素,降低纖維素的結(jié)晶度,同時(shí)增大了木質(zhì)素材料的比表面積,能夠得到較高的酶解糖化率,是一種較為有效的預(yù)處理方法[3]。

    本試驗(yàn)使用NaOH溶液對(duì)小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理,分別研究了NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)、小麥秸稈固體含量、預(yù)處理時(shí)間等因素對(duì)小麥秸稈纖維素酶水解過(guò)程的影響,得到了最佳的NaOH預(yù)處理?xiàng)l件,之后對(duì)經(jīng)最佳條件預(yù)處理后的小麥秸稈進(jìn)行了同步糖化發(fā)酵試驗(yàn),并在電子顯微鏡下觀察了預(yù)處理前后的秸稈結(jié)構(gòu)變化,進(jìn)一步明確了NaOH預(yù)處理的效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 原料 小麥秸稈取自太湖農(nóng)村,機(jī)器收割,不含秸稈根部和麥穗。

    1.1.2 酶制劑 纖維素酶購(gòu)自Sigma公司,為淡黃色液體纖維素酶。

    1.1.3 酵母菌 試驗(yàn)所用酵母為釀酒酵母BY4742, 于4 ℃下保存。

    1.2 方法

    1.2.1 小麥秸稈預(yù)處理 小麥秸稈粉碎后過(guò)80目篩,烘箱中55 ℃干燥,設(shè)置不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH、小麥秸稈固體含量及預(yù)處理時(shí)間,在121 ℃、0.2 MPa的條件下在高壓滅菌鍋中進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理結(jié)束后冷卻至室溫,加入適量的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性,之后使用高速離心機(jī)進(jìn)行離心并清洗3~5次。預(yù)處理后的小麥秸稈于105 ℃烘干,保存于干燥皿中備用。

    1.2.2 纖維素酶水解 分別取未經(jīng)預(yù)處理以及經(jīng)NaOH預(yù)處理的秸稈各4.0 g,定容至100 mL,根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[4],選取纖維素酶投加量為30 FPU/g秸稈,溫度40 ℃,檸檬酸鹽調(diào)節(jié)pH為4.8,共水解120 h,每隔24 h取樣1次,離心后取上清液進(jìn)行HPLC分析。

    1.2.3 同步糖化發(fā)酵 根據(jù)本課題組關(guān)于同步糖化發(fā)酵條件的研究,分別取未經(jīng)預(yù)處理以及最優(yōu)條件下NaOH預(yù)處理后的秸稈各1.6 g,確定固體含量為0.16 g/mL,纖維素酶投加量為35 FPU/g秸稈,酵母菌濃度8 g/L,檸檬酸鹽調(diào)節(jié)pH為4.0,溫度設(shè)置為38 ℃,同步糖化發(fā)酵120 h,每隔24 h取樣分析。

    1.3 分析方法

    1.3.1 小麥秸稈成分分析 小麥秸稈纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定采用NREL實(shí)驗(yàn)室提供的方法[5]。

    1.3.2 還原糖及乙醇含量測(cè)定 樣品中纖維二糖、葡萄糖、木糖、乙醇濃度采用Shimadzu高效液相色譜分析儀檢測(cè),檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器,色譜柱為Aminex HPX-87P Column。檢測(cè)條件:柱溫65 ℃,檢測(cè)器溫度60 ℃,流動(dòng)相為超純水,流速0.8 mL/min,進(jìn)樣量20 μL。

    1.3.3 小麥秸稈結(jié)構(gòu)分析 采用電鏡掃描觀察。樣品在室溫風(fēng)干之后平鋪于導(dǎo)電膠上,進(jìn)行離子濺射金處理45 s,用JSM-7401F場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察。

    1.3.4 計(jì)算公式 纖維素水解產(chǎn)生葡萄糖的化學(xué)方程式如方程式(1)所示,理論上,100 g纖維素水解可產(chǎn)生111.1 g葡萄糖。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的化學(xué)方程式如方程式(2)所示,理論上,100 g葡萄糖發(fā)酵可產(chǎn)生51.1 g乙醇和48.9 g CO2。由此可知,100 g纖維素理論上可產(chǎn)生56.8 g乙醇。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同NaOH預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響

    2.1.1 NaOH對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗(yàn)首先考察了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaOH預(yù)處理?xiàng)l件下,纖維素酶水解小麥秸稈的效果。分別以0.25%、0.50%、1.00%、2.00%和4.00%的NaOH溶液預(yù)處理已粉碎干燥的小麥秸稈,之后進(jìn)行120 h的水解試驗(yàn),并每隔24 h取樣進(jìn)行還原糖含量分析。經(jīng)不同NaOH溶液預(yù)處理后小麥秸稈水解產(chǎn)物中還原糖情況如圖1所示。預(yù)處理過(guò)的小麥秸稈經(jīng)過(guò)酶解后,主要產(chǎn)生了纖維二糖、葡萄糖、木糖3種還原糖,由圖1可以看出,隨預(yù)處理NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,酶解液的還原糖含量逐漸升高,其產(chǎn)量均在NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%時(shí)達(dá)到最高,其中葡萄糖含量在酶水解48 h時(shí)達(dá)到最高,為14.13 g/L。之后NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí),還原糖產(chǎn)量開(kāi)始下降,可能因?yàn)樵陬A(yù)處理過(guò)程中NaOH溶解半纖維素和木質(zhì)素的同時(shí)也水解了部分纖維素,還原糖進(jìn)入了液相,在進(jìn)行固液分離時(shí)損失[6-8]。

    2.1.2 固體含量對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗(yàn)設(shè)置預(yù)處理時(shí)的小麥秸稈固體含量分別為0.025、0.050、0.100、0.150和0.200 g/mL,采用在“2.1.1”方法中確定的NaOH預(yù)處理最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%對(duì)小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理,之后進(jìn)行120 h的酶解試驗(yàn),每24 h取樣測(cè)定其還原糖含量。不同固體含量下NaOH預(yù)處理產(chǎn)物中還原糖含量如圖2所示。由圖2可見(jiàn),預(yù)處理過(guò)程中在小麥秸稈固體含量提高到0.050 g/mL時(shí),酶解液中的3種還原糖含量均達(dá)到最高。其中葡萄糖在纖維素酶水解48 h時(shí)其濃度達(dá)到最大值14.13 g/L。之后固體含量繼續(xù)增大時(shí),其還原糖產(chǎn)量下降。分析其原因可能是預(yù)處理過(guò)程中固體含量對(duì)預(yù)處理強(qiáng)度產(chǎn)生影響,固體含量過(guò)高時(shí),因NaOH溶液的量相對(duì)減少,難以與秸稈充分接觸,從而影響了預(yù)處理效果[9,10]。

    2.1.3 預(yù)處理時(shí)間對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響 本試驗(yàn)設(shè)置預(yù)處理時(shí)間分別為15、30、50、60和90 min,采用“2.1.1”方法得到的預(yù)處理最佳NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%和“2.1.2”方法得到的最佳固體含量0.050 g/mL對(duì)小麥秸稈進(jìn)行預(yù)處理,之后進(jìn)行120 h酶解,每隔24 h取樣測(cè)定其還原糖產(chǎn)量。不同預(yù)處理時(shí)間下3種還原糖的產(chǎn)量如圖3所示。

    由圖3可見(jiàn),隨著預(yù)處理時(shí)間的增加,小麥秸稈酶解液3種還原糖含量在60 min時(shí)達(dá)到最大。其中葡萄糖濃度在酶水解24 h后達(dá)到最大值15.30 g/L。預(yù)處理50 min以上時(shí),NaOH溶液對(duì)木質(zhì)素和半纖維素的溶解基本完成,纖維素充分暴露出來(lái),預(yù)處理時(shí)間增加到60、90 min時(shí),酶解產(chǎn)生還原糖的濃度變化不大,考慮到增加預(yù)處理時(shí)間會(huì)顯著增加能耗,故將60 min確定為最佳預(yù)處理時(shí)間。

    2.2 NaOH預(yù)處理對(duì)小麥秸稈酶解效果的影響

    通過(guò)上述試驗(yàn)可以得到NaOH預(yù)處理小麥秸稈的最佳條件為NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%,小麥秸稈固體含量0.050 g/mL,預(yù)處理時(shí)間60 min。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的小麥秸稈殘?jiān)附?20 h,其反應(yīng)進(jìn)程見(jiàn)圖4。

    由圖4可知,在最佳預(yù)處理?xiàng)l件下,酶解24 h時(shí),酶解液總還原糖產(chǎn)量達(dá)到最大,為34.65 g/L,其產(chǎn)率為86.61%。而未經(jīng)預(yù)處理的小麥秸稈在酶解剛開(kāi)始時(shí)總還原糖產(chǎn)量便開(kāi)始下降,最高僅為4.80 g/L,其產(chǎn)率僅為12.01%。最佳預(yù)處理?xiàng)l件下的總還原糖產(chǎn)率也明顯高于常規(guī)的稀堿預(yù)處理的總還原糖產(chǎn)率[3]。這是因?yàn)镹aOH預(yù)處理對(duì)半纖維素和木質(zhì)素均有較好的去除效果,解除了木質(zhì)素和半纖維素對(duì)纖維素的保護(hù)作用,同時(shí)破壞纖維素大分子之間的結(jié)晶結(jié)構(gòu),增大了小麥秸稈的比表面積,改善了底物與纖維素酶的接觸效果,同時(shí)也有效減少了木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的特異性吸附,使纖維素酶可以充分作用于底物,有效提高了小麥秸稈的酶解效果[11,12]。

    2.3 小麥秸稈成分分析

    使用NREL實(shí)驗(yàn)室的方法分別測(cè)定未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈與經(jīng)過(guò)最優(yōu)條件預(yù)處理過(guò)的小麥秸稈成分,結(jié)果如表1所示。由表1可見(jiàn),小麥秸稈在經(jīng)過(guò)了最優(yōu)條件預(yù)處理后,木質(zhì)素的含量由25.73%降低至11.75%,同時(shí)纖維素的含量由39.31%升高至58.84%。表明NaOH能夠提高纖維素在底物中所占比例,同時(shí)降低木質(zhì)素等所占比例[13],有利于后續(xù)酶解進(jìn)程。

    2.4 同步糖化發(fā)酵結(jié)果

    未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈與經(jīng)過(guò)最佳條件預(yù)處理的小麥秸稈經(jīng)同步糖化發(fā)酵后上清液成分如表2所示。

    由表2可見(jiàn),未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈由于結(jié)晶以及木質(zhì)結(jié)構(gòu)的保護(hù),酶解過(guò)程受到抑制,進(jìn)而影響了酵母菌對(duì)還原糖的發(fā)酵。而經(jīng)過(guò)最佳NaOH預(yù)處理?xiàng)l件處理后,乙醇的產(chǎn)量大幅上升,由處理前的7.98 g/L上升到38.32 g/L,乙醇產(chǎn)率由22.40%上升至71.70%,無(wú)法被酵母菌利用的木糖含量也由處理前的0.80 g/L上升到了12.94 g/L。

    由此可見(jiàn),NaOH預(yù)處理不僅能夠有效去除木質(zhì)素,而且基本不影響纖維素[14],纖維素可以進(jìn)一步水解并發(fā)酵產(chǎn)生乙醇,NaOH預(yù)處理是一種高效的木質(zhì)纖維素產(chǎn)乙醇的預(yù)處理方法。

    2.5 NaOH預(yù)處理前后小麥秸稈結(jié)構(gòu)分析

    小麥秸稈粉末在NaOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%、固體含量0.050 g/mL、121 ℃、0.2 MPa的條件下預(yù)處理60 min,恢復(fù)至室溫干燥后備用。同時(shí)準(zhǔn)備一份未經(jīng)預(yù)處理的小麥秸稈粉末,干燥后備用。樣品平鋪在導(dǎo)電膠上,噴金45 s后用掃描電鏡觀察,其SEM結(jié)果如圖5所示。

    由圖5可見(jiàn),未經(jīng)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈表面光滑,纖維排列比較整齊,沒(méi)有明顯的破損和孔隙,結(jié)構(gòu)致密。經(jīng)過(guò)NaOH預(yù)處理后的小麥秸稈的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的部分結(jié)構(gòu)遭到破壞、分離,纖維和纖維束出現(xiàn)卷曲和折疊,變得柔軟疏松,排列凌亂;秸稈表面由預(yù)處理前的致密變得疏松,有序排列變得雜亂無(wú)章;原來(lái)光滑的表面上出現(xiàn)了片狀的物質(zhì),這可能是溶出的半纖維素和木質(zhì)素[15]。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的小麥秸稈的比表面積大大增加,這更有利于纖維素酶的吸附,有利于水解,從而提高了酶水解液中還原糖的得率。

    3 結(jié)論

    1)NaOH預(yù)處理小麥秸稈的最佳條件為:NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.00%,小麥秸稈固體含量0.050 g/mL,預(yù)處理時(shí)間60 min。

    2)經(jīng)過(guò)NaOH預(yù)處理的小麥秸稈水解液還原糖得率可提升74.60個(gè)百分點(diǎn)。

    3)通過(guò)SEM觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)NaOH預(yù)處理后,秸稈表面變得粗糙,有利于纖維素酶的吸附及進(jìn)一步水解。

    4)經(jīng)過(guò)最佳條件NaOH預(yù)處理的小麥秸稈進(jìn)行同步糖化發(fā)酵其乙醇產(chǎn)率提高了49.30個(gè)百分點(diǎn)。

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