不同牛種SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)多態(tài)性分析

摘要：為篩選SOCS6基因啟動(dòng)子區(qū)域單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）并研究其對啟動(dòng)子功能元件的影響，選擇品種差異較大的貴州荷斯坦奶牛和務(wù)川黑牛構(gòu)建DNA池，直接測序篩選SNP位點(diǎn)。結(jié)果表明，SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)存在4個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為T-513G、C-401T、A-332G和T-180G。生物信息學(xué)軟件預(yù)測得到SOCS6基因核心啟動(dòng)子區(qū)和CpG島，SNP位點(diǎn)導(dǎo)致附近部分轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失和新位點(diǎn)產(chǎn)生。多態(tài)性位點(diǎn)對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)有顯著影響，但并不改變CpG島大小。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制子（Suppressor of cytokine signalling，SOCS）；單核苷酸多態(tài)性（SNP）；啟動(dòng)子；貴州荷斯坦奶牛；務(wù)川黑牛

中圖分類號：S823.8；Q756 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3991-04

細(xì)胞因子誘導(dǎo)SH2蛋白（Cytokine inducible SH2 protein，CIS）和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制子（Suppressor of cytokine signalling， SOCS）是細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白的家族成員，對GH在內(nèi)的細(xì)胞因子或生長因子通路起負(fù)調(diào)控作用[1-3]。SOCS6蛋白含有SH2（Src-homology 2）結(jié)構(gòu)域、較長的N端結(jié)構(gòu)域和C端SOCS box[4]，和其他SOCS蛋白不同，SOCS6蛋白N端結(jié)構(gòu)域具有300個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)[5]，SOCS6蛋白作為E3泛素連接酶，利用其SH2結(jié)構(gòu)域與c-KIT蛋白pY568位點(diǎn)結(jié)合，與c-KIT作用抑制干細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增[6]。SOCS6蛋白可能不與細(xì)胞因子信號途徑中的細(xì)胞因子相互作用，不抑制細(xì)胞因子受體信號通路，但會減少STAT3蛋白水平[7]，而STAT3可作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控與生長相關(guān)基因的表達(dá)。SOCS6轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞因子信號通路和造血系統(tǒng)正常，但葡萄糖代謝水平提高，并出現(xiàn)生長遲緩現(xiàn)象[8]。

豬和人的SOCS6蛋白有92.3%的氨基酸同源性，SOCS6蛋白在豬多種組織中有相似表達(dá)，大腸、小腸內(nèi)表達(dá)量較高[9]。對牛的SOCS6基因研究極少，基因啟動(dòng)子變異通過改變RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控序列的結(jié)合來影響基因表達(dá)水平。本研究為篩選SOCS6基因啟動(dòng)子區(qū)單核苷酸的多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP），研究其對啟動(dòng)子功能元件的影響，選擇生長性能差異明顯的務(wù)川黑牛和貴州荷斯坦奶牛構(gòu)建DNA池，測序后用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接、校正，BLAST比對分析SOCS6基因多態(tài)性，將牛SOCS6基因啟動(dòng)子區(qū)篩選到的SNP位點(diǎn)與NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，運(yùn)用不同生物信息學(xué)軟件預(yù)測核心啟動(dòng)子區(qū)和CpG島，分析SNP位點(diǎn)對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州荷斯坦奶牛54個(gè)血樣采自貴陽三聯(lián)乳業(yè)公司第二奶牛場，務(wù)川黑牛45個(gè)血樣采自貴州務(wù)川仡佬族苗族自治縣仡佬牧業(yè)公司牛場。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取與DNA池的構(gòu)建 使用血液基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取牛的基因組DNA，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量，使用紫外分光光度計(jì)測定DNA樣品濃度，每個(gè)樣品測3次，取平均值。將務(wù)川黑牛和貴州荷斯坦奶牛DNA樣品濃度分別調(diào)至100 ng/μL，各取5 μL混合構(gòu)建兩個(gè)DNA池。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 根據(jù)牛SOCS6基因（GenBank登錄號：AC_000181.1）DNA序列，設(shè)計(jì)1對特異性引物擴(kuò)增SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)和第1外顯子部分序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Master Mix試劑12.5 μL，上、下游引物（濃度為10 pmol/μL）各1.5 μL，基因組DNA 2.5 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，60.6 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，純化回收后的PCR產(chǎn)物送諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)軟件是根據(jù)數(shù)學(xué)模型或不同的算法來預(yù)測結(jié)果，不同的軟件可能會因?yàn)橛?jì)算方法或閾值設(shè)定差異而得到不同的預(yù)測結(jié)果，利用不同的軟件進(jìn)行比較分析可以最大限度地提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，充分發(fā)揮其參考價(jià)值。將突變序列分別遞交在線軟件進(jìn)行預(yù)測，并對序列突變之后軟件預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行分析，用Promoter SCAN、Neural Network Promoter Prediction、Promoter 2.0進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測；TFSEARCH、Softberry、GeneBuilder預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；Bio-soft、MethPrimer和Webgene預(yù)測CpG島，分析突變對CpG島范圍、起始位置和GC含量等的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA池的PCR擴(kuò)增

利用構(gòu)建的DNA池PCR分別擴(kuò)增出務(wù)川黑牛和貴州荷斯坦奶牛SOCS6基因目的序列967 bp（圖1）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后雙向測序，經(jīng)BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNP位點(diǎn)，假設(shè)SOCS6基因第1外顯子第1位為+1位，4個(gè)SNP位點(diǎn)分別為：T-513G、C-401T、A-332G、T-180G（圖2）。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)，T-513G為新發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，將該位點(diǎn)信息提交到SNP數(shù)據(jù)庫（登錄號為ss538994478）。在這兩個(gè)牛種中，4個(gè)SNP位點(diǎn)均表現(xiàn)出相似的多態(tài)性特征，推測這4個(gè)SNP位點(diǎn)可能普遍存在不同牛種中。

2.2 SOCS6基因啟動(dòng)子預(yù)測

利用3種軟件對所得的SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測（表2）。除Promoter 2.0外，其他2種軟件均預(yù)測得到核心啟動(dòng)子區(qū)，說明SOCS6基因具有明顯的啟動(dòng)子識別特征。Neural Network Promoter Prediction發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域。Promoter SCAN預(yù)測在-667 bp存在核心啟動(dòng)子區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)T-513G、A-332G位點(diǎn)位于核心啟動(dòng)子區(qū)域，該突變可能會對SOCS6基因調(diào)控表達(dá)有影響。

2.3 SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

使用TFSEARCH、GeneBuilder、Softberry對SOCS6基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測及綜合分析（表3）。軟件評分以10分為滿分，評分越高說明預(yù)測的準(zhǔn)確性和可信度越高。預(yù)測結(jié)果表明，SOCS6基因序列中包含ETF、SP1、AP-1、NF-κB、AP-4、Hb、ADR1、SRY、HSF、C/EBP、CdxA、MyoD等重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，含有TATA box、GATA box、GC box等啟動(dòng)子重要元件。將突變的序列再次提交，比對后發(fā)現(xiàn)突變造成轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)明顯變化。TFSEARCH軟件預(yù)測結(jié)果表明，T-513G突變附近原本存在的MZF1和HSF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失了；T-401C突變導(dǎo)致該處存在的AML-1a、Brn-2結(jié)合位點(diǎn)消失。A-332G突變導(dǎo)致-339 bp出現(xiàn)新的GCN4、cap結(jié)合位點(diǎn)；T-180G突變導(dǎo)致該位點(diǎn)出現(xiàn)一個(gè)新的E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)SNP導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生較大改變，造成部分原結(jié)合位點(diǎn)消失及新結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生，這可能對SOCS6基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮作用。

2.4 SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)CpG島預(yù)測

啟動(dòng)子區(qū)CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)，可與特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，但異常甲基化的CpG島顯著降低與反式作用因子的結(jié)合活性，DNA甲基化可直接干擾特異性轉(zhuǎn)錄因子EZF、CREB、APZ等與啟動(dòng)子序列結(jié)合抑制基因表達(dá)[10]。用Webgene、Bio-soft、MethPrimer 3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測目標(biāo)序列CpG島，判定標(biāo)準(zhǔn)為GC含量>50%，Obs/Exp比值>0.6和CpG島范圍>100 bp，以轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為0位，上、下游分別以正、負(fù)號標(biāo)明，Webgene和Bio-soft軟件均預(yù)測到在目標(biāo)序列中有CpG島存在，兩者預(yù)測結(jié)果一致。C-401T、A-332G位點(diǎn)均處于各軟件預(yù)測的CpG島區(qū)，但對核心啟動(dòng)子范圍和起始位點(diǎn)無明顯影響，提示SNP位點(diǎn)通過影響SOCS6基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平來調(diào)控基因表達(dá)的可能性較小。

3 小結(jié)與討論

細(xì)胞因子信號抑制子家族在JAK-STAT信號通路中起負(fù)調(diào)控作用，該家族主要包含CIS和SOCS 1～7共8個(gè)成員[11]。SOCS6蛋白與人類癌癥、腫瘤、糖尿病等疾病相關(guān)，在病變組織中SOCS6基因的mRNA表達(dá)水平通常較低。在成纖維細(xì)胞中加入血清或胰島素會瞬時(shí)提高SOCS6蛋白表達(dá)量[12]。SOCS6蛋白對胰島素信號通路有重要調(diào)控作用，胰島素刺激后SOCS6蛋白與胰島素受體結(jié)合從而抑制ERK1/2、蛋白激酶B和IRS1活性[13]，并通過與IRS-2、IRS-4和磷酸肌醇的p85亞基相互作用調(diào)控胰島素受體信號[14]。此外，SOCS6蛋白對造血中重要的生長因子受體Fit3有負(fù)向調(diào)控作用，F(xiàn)it3配體誘導(dǎo)SOCS6蛋白酪氨酸磷酸化，隨后SOCS6蛋白直接與Fit3蛋白的磷酸酪氨酸591和919位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)Fit3蛋白化進(jìn)而降解，抑制細(xì)胞擴(kuò)增[15]。SOCS6蛋白還能作用于線粒體誘導(dǎo)其斷裂，進(jìn)而通過調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)和凋亡水平影響機(jī)體能量代謝[16]。

DNA池是一種將同種屬樣本調(diào)整為相同濃度后構(gòu)建混合池的方法，具有提高檢測效率，縮短試驗(yàn)周期，降低成本等優(yōu)點(diǎn)[17]。本研究采用該方法在SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)篩選到4個(gè)SNP位點(diǎn)，T-513G為新發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)（登錄號為ss538994478）。運(yùn)用不同軟件預(yù)測核心啟動(dòng)子區(qū)域會有一定差異，多種軟件綜合分析則可最大限度提高預(yù)測準(zhǔn)確性。SOCS6基因5′調(diào)控區(qū)具有TATA box、GC box、CATT box等啟動(dòng)子特征，T-513G、A-332G位點(diǎn)位于核心啟動(dòng)子區(qū)域，其突變可能在調(diào)控SOCS6基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。4個(gè)SNP位點(diǎn)突變均導(dǎo)致不同轉(zhuǎn)錄因子原有結(jié)合位點(diǎn)消失，產(chǎn)生新結(jié)合位點(diǎn)，提示突變位點(diǎn)可直接影響特異轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控序列的結(jié)合。DNA甲基化可顯著降低靶基因表達(dá)水平，生物信息學(xué)軟件預(yù)測SOCS6基因啟動(dòng)子區(qū)域具有范圍相同的CpG島，說明DNA甲基化水平對SOCS6基因表達(dá)調(diào)控有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)處于各軟件預(yù)測的CpG島區(qū)，但對核心啟動(dòng)子范圍和起始位點(diǎn)無明顯影響，顯示SNP位點(diǎn)不在甲基化水平上影響SOCS6基因表達(dá)水平。SOCS6基因SNP分析為進(jìn)一步研究牛SOCS6基因啟動(dòng)子功能，闡明其蛋白作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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