黨參多糖磷酸酯化合成工藝的均勻設計優(yōu)化

摘要：采用多聚磷酸法對黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]多糖進行磷酸酯化反應，利用均勻設計試驗U8（44）對黨參多糖磷酸酯化合成工藝進行優(yōu)化。采用鉬酸銨法測定磷酸根的含量，確定了黨參多糖磷酸酯化反應體系的最佳反應條件為溫度87 ℃、時間6.3 h、每20 mL多糖溶液加入20 mL多聚磷酸鈉溶液pH 10，在此體系下，磷酸根含量為5.26%。

關鍵詞：黨參[Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.]多糖；磷酸酯化；均勻設計

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3936-03

黨參為桔?？浦参稂h參[Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]的干燥根[1]。黨參是常用中藥，具多種功效。黨參的主要成分有多糖、黨參皂苷、甾醇等多種物質。試驗研究表明，黨參多糖是黨參中的有效成分之一[2]。多糖類具有增強機體免疫、抗衰老的作用，在機體中表現出激活免疫細胞通道、激活吞噬細胞活性、增強免疫力、抗腫瘤、抗病毒和清除自由基等作用[3-5]。多糖進一步衍生、接枝、交聯等結構改造后，在近年的研究中被用于制作溫敏凝膠、pH凝膠，作為新的載藥體系或者用于開發(fā)新的疫苗[6]。多糖種類很多，然而多糖酯化物種類和數量有限。多糖的磷酸酯化改造方法主要有磷酸和磷酸酐法、磷酸鹽法、環(huán)三聚磷酸酯法、磷酰氯法等[7]。磷酸酯化修飾后的一些藥物以及倍他米松、注射用克林霉素等藥物的磷酸酯化物在療效及用量上得到了很大改善[8]。為了進一步研究多糖磷酸酯化的實際應用，研究多糖磷酸酯化合成途徑顯得尤為重要，同時由于磷酸酯化物也是一種重要的多糖酯化物，因而對多糖結構進行改性研究，對合成工藝以及后續(xù)的藥理進行研究有現實的價值和意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 黨參購自貴州省遵義市道真縣黨參種植戶，經遵義醫(yī)學院楊建文教授鑒定為桔?？浦参锎h參。黨參多糖為自制；透析袋（截留分子質量為3.5 ku），無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水硫酸鈉、鹽酸、鉬酸銨、維生素C（VC）、三氯乙酸、磷酸氫二鈉及多聚磷酸鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器與設備 CL-2型恒溫磁力攪拌器購自鄭州長城科工貿有限公司，L550型低速自動平衡離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司，R-210型真空旋轉蒸發(fā)儀購自瑞士Buchi公司，DZF-250型真空干燥箱購自鄭州長城科工貿有限公司，U-3100型紫外分光光度計購自日本日立公司，PHS-3CT型精密酸度計購自上海大普儀器有限公司，XMTB型數顯水浴鍋購自浙江余姚市工業(yè)儀表二廠，SX-5-12箱式電阻爐購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠，AL204分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 黨參多糖的制備 取80 ℃烘干及粉碎后的黨參1 000 g，加入足量的80%乙醇加熱回流脫脂3次，向藥渣加10倍體積的水煎煮3次，第一次3 h，第二次2 h，第三次1 h；抽濾藥渣，合并3次濾液后濃縮。向濃縮液加入95%乙醇到乙醇體積分數為80%，于4 ℃靜置12 h后，以3 000 r/min離心，收集沉淀部分，真空干燥后復溶，加95%乙醇到乙醇體積分數為80%后，離心，收集沉淀，凍干，重復此操作3次，至凍干物呈白色后復溶，加入相對于粗多糖質量分數為1%的胃蛋白酶，于室溫放置12 h后用Savege法除去蛋白質，然后用截留分子質量為3.5 ku的透析袋處理，得到黨參多糖。

1.2.2 黨參多糖含量的測定 取烘干至恒重的葡萄糖作為標準物質配制母液，然后用紫外分光光度計做全波長掃描，選擇490 nm作為特征吸收波長，采用苯酚-硫酸法在490 nm處對黨參多糖含量進行測定[9]。

1.2.3 黨參多糖的磷酸酯化反應 在250 mL三口燒瓶中加入20 mL經過預處理的多糖溶液，加入5 mL 5 g/L的Na2SO4溶液，將加好的溶液加熱到一定溫度后，滴加多聚磷酸鈉溶液，加入100 g/L的NaOH溶液調節(jié)至溶液呈堿性，在恒定溫度下反應，按照試驗設計條件進行黨參多糖磷酸酯化反應。待多糖磷酸酯化反應完全后，將反應物液體倒入燒杯中，邊攪拌邊加入3倍體積的無水乙醇，于4 ℃下靜置過夜，離心后收集沉淀物，用去離子水復溶后，采用截留分子質量為3.5 ku的透析袋透析72 h，然后收集、濃縮、干燥，得到磷酸酯化多糖待測。

1.2.4 均勻設計試驗 在參考多糖結構修飾的基礎上[10]，依據多糖磷酸酯化單因素試驗結果，選取了溫度、時間、投料比（V多糖/V多聚磷酸鈉）和pH 4個影響因素，設計了均勻設計試驗U8（44）[11]，以優(yōu)化多糖磷酸酯化合成條件，均勻設計試驗的因素與水平見表1。

1.2.5 磷酸根含量的分析方法

1）磷酸根標準曲線的繪制。精密稱取50 mg于120 ℃干燥至恒重的無水NaH2PO4，在室溫下用去離子定容至100 mL容量瓶中，配得0.5 mg/mL磷酸根準溶液備用。精密吸取標準溶液2、3、4、5、6、7 mL置于50 mL容量瓶中，另取一個50 mL容量瓶做空白對照，7只容量瓶中均加去離子水至25 mL左右后，加入已配制好的VC溶液、鉬酸銨溶液，搖勻后定容到刻度線，于30 ℃水浴15 min后冷卻至室溫，于580 nm處測定吸光度，繪制標準曲線[12]。

2）樣品的處理及磷酸根含量的測定。精密稱取反應后待測的磷酸酯化多糖0.1 g，裝入坩堝后置于箱式電阻爐中，于200 ℃充分灼燒2 h后升溫到600 ℃灼燒6 h，待其冷卻后，在已灰化完全的坩堝內加入18.25%的HCl 2 mL，攪拌使灼燒后的灰分完全溶解，然后取上清液1 mL加入到50 mL容量瓶中，用去離子水補足至刻度后得到樣品的磷酸鹽溶液作母液備用。精密量取母液2 mL加入另一個50 mL容量瓶中，加入適量去離子水后搖勻，加入1 mL的VC溶液搖勻，再加入2 mL的鉬酸銨溶液搖勻，并用去離子水定容至刻度，于35 ℃水浴10 min后冷卻至室溫，用紫外分光光度計在580 nm處測定吸光度。根據磷酸根標準方程，計算出磷酸根含量[13]。

2 結果與分析

2.1 磷酸根標準方程

2.2 均勻設計試驗分析

2.3 驗證試驗結果

稱取3 g多糖，分成3份，各加入20 mL去離子水充分攪拌溶解，然后于溫度87 ℃、時間6.3 h、每20 mL多糖溶液加入20 mL多聚磷酸鈉溶液、pH 10條件下反應。共進行3次酯化試驗，得到3份黨參磷酸酯化多糖，其磷酸根含量分別為5.20%、5.31%、5.27%，磷酸根含量的平均值為5.26%。與均勻設計試驗結果的差異不顯著，驗證試驗說明均勻設計試驗篩選的黨參多糖磷酸酯化工藝可靠、穩(wěn)定。

3 結論與討論

驗證試驗結果表明，黨參多糖磷酸酯化過程中能采用多聚磷酸鈉作為磷酸酯化試劑，在87 ℃、每20 mL多糖溶液加入20 mL多聚磷酸鈉溶液、pH 10的條件反應6.30 h時，黨參多糖磷酸酯化反應能夠得到磷酸根含量達到5.26%的多糖磷酸酯化物。多糖類磷酸酯化反應體系在液體環(huán)境下發(fā)生反應，對糖類的活性基團不會造成太大的結構重組和破壞，反應控制和操作較適合于后期研究。多糖磷酸酯化衍生物的合成，為黨參多糖在食品工藝開發(fā)應用，或作為藥物載體研發(fā)等方面的綜合利用進行了探索，也為進一步的藥理毒理及生物相容性探索打下了試驗基礎，同時也證明了均勻設計可以作為黨參多糖磷酸酯化篩選工藝研究的方法。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[Z]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010. 264-265.

[2] 陳克克，王喆之.黨參多糖的研究進展[J].現代生物學進展，2007， 7（4）：635-637.

[3] 謝明勇，聶少平.天然產物活性多糖結構與功能研究進展[J].中國食品學報，2010，10（2）：1-11.

[4] 丁保金，金麗琴，呂建新. 多糖的生物活性研究進展[J]. 中國藥學雜志，2004，39（8）：561-564.

[5] 黃益麗，鄭天凌.海洋生物活性多糖的研究現狀與展望[J].海洋科學，2004，28（4）：58-61.

[6] 董 群，方積年.多糖在醫(yī)藥領域中的應用[J].中國藥學雜志，2001，36（10）：649-652.

[7] 陳曉明，田庚元.多糖磷酸酯化的研究進展[J].有機化學，2002， 22（11）：835-839.

[8] 段艷冰，黃德虎，劉 實，等.磷酸酯化在新藥開發(fā)中的應用[J].醫(yī)藥導報，2011，30（8）：1056-1057.

[9] 周術濤，雷志力，俞巧仙，等.均勻設計與正交設計聯用優(yōu)選鐵皮石斛多糖提取工藝的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（11）：296-297，314.

[10] 孫 雪，潘道東，曾小群，等.滸苔多糖的磷酸化修飾工藝[J].食品科學，2011，32（24）：73-77.

[11] 方開泰.均勻設計與均勻設計表[M].北京：科學出版社，1994. 70.

[12] 張 難，邱樹毅，吳遠根，等.磷酸化香菇多糖制備工藝的研究[J].食品科技，2008（2）：21-25.

[13] 丁筑紅，顧采琴，楊 娟，等.微波酯化制備淀粉磷酸單酯及糊特性研究[J].食品科學，2005，26（8）：259-264.