響應(yīng)面法優(yōu)化煙草游離煙堿的提取工藝研究

摘要： 為研究提取因素對(duì)煙草中游離煙堿的提取得率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取溶劑中液料比、提取時(shí)間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速，進(jìn)行4因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法（RSM）分析了4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值（游離煙堿得率）的影響。結(jié)果表明，水提取-有機(jī)溶劑萃取法提取煙草中游離煙堿的最優(yōu)條件如下： 液料比30∶1（V/m，mL/g），提取時(shí)間33 min，搖床轉(zhuǎn)速212 r/min和提取溫度34 ℃。在最優(yōu)的條件下進(jìn)行了5次驗(yàn)證試驗(yàn)，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與理論值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%，說(shuō)明該優(yōu)化方法可行。

關(guān)鍵詞：煙草；游離煙堿；提??；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3922-04

煙堿是煙草中的一種特殊的生物堿，以游離態(tài)、質(zhì)子態(tài)兩種形態(tài)存在[1]。卷煙的品質(zhì)和勁頭不僅與煙草及主流煙氣中的煙堿總含量有關(guān)，與煙堿形態(tài)也有著密切的關(guān)系，游離態(tài)煙堿易揮發(fā)，主要以氣相形態(tài)存在，易于穿透口腔黏膜從而更快速地被人體吸收，能對(duì)中樞神經(jīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的作用，抽吸時(shí)具有較強(qiáng)的勁頭[2，3]，而質(zhì)子態(tài)煙堿被口腔吸收的相對(duì)慢一點(diǎn)，抽吸時(shí)勁頭較弱。所以針對(duì)不同形態(tài)的煙堿進(jìn)行研究和測(cè)定是十分必要的。

煙草中煙堿與有機(jī)酸結(jié)合所形成的鹽類(lèi)為極易解離的弱酸弱堿鹽，因而要準(zhǔn)確測(cè)定煙草中游離態(tài)煙堿的絕對(duì)含量有一定的難度，其提取方法是至關(guān)重要的[4]。目前煙草中游離煙堿含量的提取和測(cè)定方法各異，測(cè)定結(jié)果也有所不同，為得到一個(gè)穩(wěn)定而準(zhǔn)確的可以用于長(zhǎng)期檢測(cè)的方法，筆者根據(jù)前期試驗(yàn)和參考文獻(xiàn)[5，6]，利用響應(yīng)面法[7]優(yōu)化了煙草游離煙堿提取條件，旨在為煙草煙堿形態(tài)對(duì)煙草品質(zhì)的影響提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙堿（純度大于98%，0 ℃下保存）；正十七烷（純度大于99%，New Jersey USA）；三氯甲烷（色譜純，北京化工廠）；氫氧化鈉（AR，天津市科密毆化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；煙葉（石家莊卷煙廠提供）；BS-4GBS-4G全溫振蕩培養(yǎng)箱（江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司）；6890GC/5973MS氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

煙草中游離煙堿的測(cè)定[5]：稱(chēng)取約1 g樣品，放入150 mL的具塞三角瓶中，加入30 mL用0.01 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)至pH 7.00的去CO2蒸餾水，在室溫下振蕩萃取0.5 h，過(guò)濾，取濾液15 mL至250 mL分液漏斗中，用三氯甲烷（含內(nèi)標(biāo)： 正十七烷）萃取2次，每次20 mL，合并有機(jī)相，作為氣相色譜分析。采用內(nèi)標(biāo)-工作曲線法對(duì)氣相色譜鑒定出的游離煙堿進(jìn)行定量。

1.3 響應(yīng)曲面（RSM） 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn) 按文獻(xiàn)[5]考察液料比、提取時(shí)間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速等因素對(duì)游離煙堿提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)筆者前期試驗(yàn)[5]，選取液料比、提取時(shí)間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速為關(guān)鍵影響因子， 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，因子水平及編碼見(jiàn)表1。以游離煙堿得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。數(shù)據(jù)分析及模型建立由Design Expert （Version 7.1.3）軟件完成。該模型利用最小二乘法擬合響應(yīng)值與自變量之間的關(guān)系方程： y=B0+B1x1+B2x2+B3x3+B4x4+B12x1x2+B13x1x3+B14x1x4+B23x2x3+B24x2x4+B34x3x4+B11x12+B22x22+B33x32+B44x42，式中：y為響應(yīng)值， B0為常數(shù)項(xiàng)，B1、B2、B3、B4分別為線性系數(shù)，B12、B13、B14、B23、B24、B34為交互項(xiàng)系數(shù)，B11、B22、B33、B44為二次項(xiàng)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)液料比為30∶1、時(shí)間為30 min、溫度為40 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，游離煙堿的提取效果較好。

2.2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 多元二次方程的建立 根據(jù)單因素的液料比、提取時(shí)間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定響應(yīng)面試驗(yàn)各因素的水平范圍。采用Design-Expert軟件為輔助手段設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，選用Box-Behnken模型（BBD）設(shè)計(jì)進(jìn)行了29組試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert7.1.3軟件，通過(guò)表2中游離煙堿提取率試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得游離煙堿提取率對(duì)編碼自變量液料比、提取時(shí)間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速的二次多項(xiàng)回歸方程：

y=6.77+0.18x1+0.029x2+0.10x3-0.67x4+0.073x1x2+0.18x1x3-0.36x1x4-0.37x2x3+0.13x2x4-0.39x3x4-0.60x12-0.36x22-0.53x32-0.80x42

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，總回歸達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明本試驗(yàn)與所選因素之間存在極顯著的回歸關(guān)系，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確。

由表3可以看出，該模型F=32.39，P<0.01，表明模型極顯著，不同處理可導(dǎo)致不同的響應(yīng)。失擬項(xiàng)F=4.71，P=0.072 4，模型失擬不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.963 0，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著；而調(diào)整決定系數(shù)R2=0.926 0，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有92.6%來(lái)源于所選變量，即液料比、提取時(shí)間、提取溫度和搖床轉(zhuǎn)速。因此，該回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況較好，試驗(yàn)誤差小，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。

從系數(shù)項(xiàng)的P值來(lái)分析，方程的一次項(xiàng)（x1、x4）、二次項(xiàng)（x12、x22、x32、x42）、交互項(xiàng)（x1x4、x2x3、x3x4）都達(dá)到極顯著水平（P<0.01），說(shuō)明各具體試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。游離煙堿提取率與試驗(yàn)因子之間存在極顯著的回歸關(guān)系，其優(yōu)化的方程為：

y=6.77+0.18x1-0.67x4-0.36x1x4-0.37x2x3-

0.39x3x4-0.60x12-0.36x22-0.53x32-0.80x42

通過(guò)游離煙堿提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得最優(yōu)萃取工藝條件：提取時(shí)間33.17 min、液料比29.36∶1、搖床轉(zhuǎn)速212.46 r/min和提取溫度34.49 ℃。在此條件下，游離煙堿提取率理論值可達(dá)6.98 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的局限性，同時(shí)達(dá)到節(jié)省時(shí)間、節(jié)約試劑、萃取效果好的目的，將游離煙堿提取工藝條件修正為：提取時(shí)間33 min、液料比30∶1、搖床轉(zhuǎn)速212 r/min和提取溫度34 ℃。在此條件下再次進(jìn)行5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與理論值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%，兩者吻合較好， 說(shuō)明模型可行。

2.2.3 游離煙堿提取工藝的響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

由回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖如圖3、圖4、圖5所示。通過(guò)該組動(dòng)態(tài)圖可評(píng)價(jià)試驗(yàn)因子對(duì)游離煙堿提取率的兩兩交互作用，以及確定各個(gè)因素的最佳水平范圍。等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著[7]。

由圖3、圖4、圖5可知，搖床轉(zhuǎn)速、液料比是影響游離煙堿提取率的最顯著因素，表現(xiàn)為等高曲線陡峭；提取溫度和提取時(shí)間次之，表現(xiàn)為等高曲線較平滑，說(shuō)明提取溫度和提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值影響較小。

由圖3 可知， 在溫度為30～42 ℃時(shí)，提取時(shí)間為24～40 min 時(shí)，游離煙堿提取率較大。提取時(shí)間比溫度對(duì)游離煙堿提取量的影響大。隨著提取時(shí)間的增大，游離煙堿提取量在不斷增大，當(dāng)提取溫度在一定范圍內(nèi)（<42 ℃），游離煙堿提取量隨著時(shí)間的增加不斷增大，而當(dāng)溫度繼續(xù)增大時(shí)，游離煙堿提取率反而減少。

由圖4可知， 在轉(zhuǎn)速為170～235 r/min時(shí)，液料比為（26～34）∶1 （mL∶g） 時(shí)，游離煙堿提取率較大。轉(zhuǎn)速較液料比對(duì)游離煙堿提取量的影響大。隨著轉(zhuǎn)速的增大，游離煙堿提取量在不斷增大，當(dāng)提取轉(zhuǎn)速在一定范圍內(nèi)（<170 r/min），游離煙堿提取量隨著液料比的增加不斷增大， 而當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大時(shí)，游離煙堿提取率反而減少。

由圖5可知， 在轉(zhuǎn)速為160～250 r/min時(shí)， 溫度為30～44 ℃時(shí)， 游離煙堿提取率較大，可達(dá)6.496 6 mg/g以上。轉(zhuǎn)速比溫度對(duì)游離煙堿提取量的影響大。隨著轉(zhuǎn)速的增大，游離煙堿提取量不斷增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速在一定范圍內(nèi)（<160 r/min），游離煙堿提取量隨著溫度的增加不斷增大，而當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大時(shí)，游離煙堿提取率反而減少。

3 結(jié)論

1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化水-有機(jī)溶劑提取煙草中游離煙堿的條件?；貧w分析結(jié)果表明，搖床轉(zhuǎn)速和液料比對(duì)游離煙堿得率的影響顯著；時(shí)間與溫度，轉(zhuǎn)速和液料比，轉(zhuǎn)速和溫度的交互項(xiàng)對(duì)游離煙堿得率影響高度顯著。

2）游離煙堿得率響應(yīng)方程的回歸分析和驗(yàn)證試驗(yàn)表明本研究方法合理可行。用水-有機(jī)溶劑從煙草中提取游離煙堿的最佳條件為液料比30∶1，提取時(shí)間33 min，搖床轉(zhuǎn)速212 r/min和提取溫度34 ℃，游離煙堿的平均得率為7.01 mg/g，與預(yù)測(cè)值（6.98 mg/g）的誤差為0.43%。

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