草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的過氧化物同工酶的比較分析

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（PAGE）技術對草地早熟禾（Poa pratensis L.）和青海扁莖早熟禾（Poa pratensis var. cv. Qinghai）的過氧化物酶（POD）同工酶進行檢測和分析，從生化水平探討兩者的親緣關系及遺傳差異。結果表明，草地早熟禾與青海扁莖早熟禾在幼葉期、旗葉期的酶譜分別具共有帶8條、6條，其酶帶數(shù)量、帶級、位點及活性強度各不相同，形成了各自特有的酶譜特征。在幼葉期，青海扁莖早熟禾具1條特征譜帶，而草地早熟禾沒有；在旗葉期，草地早熟禾具3條特征譜帶，而青海扁莖早熟禾沒有。利用這些酶譜特征找出供試材料間的細微差異是可行的，是兩者進行生化水平鑒定的有利指標。

關鍵詞：草地早熟禾（Poa pratensis L.）；青海扁莖早熟禾（Poa pratensis var. cv. Qinghai）；POD同工酶；聚丙烯酰胺凝膠電泳

中圖分類號：S54 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3901-04

草地早熟禾（Poa pratensis L.）屬于禾本科早熟禾屬的多年生草本植物，具有直伸或匍匐的根莖，且根莖繁生力強，耐牲畜踐踏，營養(yǎng)豐富，是各種牲畜喜食的優(yōu)質牧草[1-3]。青海扁莖早熟禾（Poa pratensis var. cv. Qinghai）為草地早熟禾的變種，是青海省畜牧獸醫(yī)科學院草原研究所馴化選育出的青藏高原首個根莖型野生栽培新草種，具有根莖發(fā)達、分蘗性強的特性，固土保水能力很強。草地早熟禾和青海扁莖早熟禾均既能進行種子繁殖也能進行根莖無性繁殖，具有極強的抗寒性和耐旱性，是青藏高原高海拔地區(qū)人工草地建設和改良、水土保持以及生態(tài)環(huán)境建設的首選草種，尤其適合三江源區(qū)“黑土型”退化草地植被的恢復與重建[4-8]。

青海扁莖早熟禾為草地早熟禾的變種，二者的形態(tài)特征較為相似，可作為分類依據(jù)的器官結構較細微，受環(huán)境影響變異性較大，故形態(tài)學變異很難反映其遺傳差異。而目前對青海扁莖早熟禾遺傳特性及雜交育種的研究少有報道，關于其與草地早熟禾在生化水平上的遺傳研究則未見報道。本研究通過對不同生育期的草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的POD同工酶進行分析，從生化水平上探討其親緣關系及遺傳差異，為該生態(tài)草種的深入研究及合理的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試材草地早熟禾和青海扁莖早熟禾種子由青海省畜牧獸醫(yī)科學院草原研究所提供。于2010年10月將材料播種于花盆，各材料均設3次重復，室內土培。于2010年11月和12月分別采取其健康幼葉和旗葉作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 分別稱取草地早熟禾和青海扁莖早熟禾的葉片（幼葉和旗葉）各0.4 g，洗凈用濾紙吸干水分，剪碎置于預冷的小研缽中，滴入1.8 mL提樣緩沖液，在冰浴中研磨勻漿，移入離心管中，10 000 r/min，4 ℃，離心15 min，取上清液0.5 mL加入等量的樣品處理液備用。

1.2.2 電泳 采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術[9]，分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為3.0%。電極緩沖液為Tris-Gly緩沖液（pH 8.3），每槽上樣量為20 mL。電泳時，采取穩(wěn)流電泳，濃縮膠電壓為200 V，分離膠電壓為220 V，溫度4 ℃，恒壓電泳至溴酚藍遷移到距凝膠末端1.0 cm處為止。

1.2.3 染色、固定及照相 聯(lián)苯胺法染色[9]，呈現(xiàn)酶帶后取出凝膠，用水漂洗終止染色，用生物凝膠成像系統(tǒng)照相。根據(jù)同工酶遷移率Rf值（Rf=酶帶的遷移距離/前沿指示劑的遷移距離）繪制模式圖，標定酶帶位置。

2 結果與分析

2.1 草地早熟禾與青海扁莖早熟禾幼葉期的POD同工酶酶譜特征

2.1.1 酶帶及酶譜分布特征 由圖1可知，兩種試材的POD同工酶經(jīng)電泳后，顯示的酶譜帶8～9條不等，從酶譜表征可以看出，草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的酶譜上有8條共同的譜帶，同類品種的酶譜具有較穩(wěn)定的相似性。把它們分成A、B、C、D 4個區(qū)，其中A區(qū)有1條酶帶，染色較深，兩種植物均有表現(xiàn)；B區(qū)有2條酶帶。C區(qū)酶帶數(shù)2～3條不等，該區(qū)染色最深，活性最高；D區(qū)有3條酶帶，染色較淺。C1是青海扁莖早熟禾幼葉的特征譜帶（Rf=0.23），而草地早熟禾沒有這條譜帶。

2.1.2 酶的活性與含量 酶帶的染色深淺在一定程度上也反映酶活性的強弱不同。本試驗中，草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的POD同工酶染色深淺不同，前者較后者染色深，說明草地早熟禾的POD同工酶活性較強，而扁莖早熟禾的活性較弱。

2.1.3 POD酶譜的遷移率 由表1可知，草地早熟禾與青海扁莖早熟禾溴酚藍（即前沿指示劑）在幼葉期的遷移率差異不大。兩種試材在幼葉期POD同工酶共顯現(xiàn)出17條酶帶（草地早熟禾8條，青海扁莖早熟禾9條），Rf值變動在0.02～0.49之間，酶帶出現(xiàn)的頻率差異不是很大，說明試材間遺傳相似程度較高。

2.2 草地早熟禾與青海扁莖早熟禾旗葉期POD同工酶酶譜特征

2.2.1 酶帶及酶譜分布特征 由圖2可知，兩種試材的POD同工酶經(jīng)電泳后，顯示的酶譜帶6～9條不等，從酶譜表征可以看出，同類品種的酶譜具有較穩(wěn)定的相似性。把它們分成A、B、C、D 4個區(qū)，其中A區(qū)有1條酶帶，染色較深，兩種植物均有表現(xiàn)；B區(qū)有2條酶帶，分別為染色較深的條帶和染色較淺的條帶，2條帶因植物的不同，其分布表現(xiàn)差異。C區(qū)染色淺，酶帶數(shù)3條，兩者的POD同工酶在該區(qū)表現(xiàn)出比較大的差異；D區(qū)有3條酶帶，染色較淺。D區(qū)是草地早熟禾的特征帶（Rf=0.51～0.60），為草地早熟禾的旗葉期所獨有的譜帶。

2.2.2 酶的活性與含量 草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的POD同工酶旗葉期染色不同，前者較后者染色深，表明草地早熟禾旗葉期POD同工酶的活性較強，而扁莖早熟禾的活性較弱。

2.2.3 POD同工酶酶譜的遷移率 由表2可知，草地早熟禾與青海扁莖早熟禾溴酚藍（即前沿指示劑）在旗葉期的遷移率差異不大。草地早熟禾與青海扁莖早熟禾旗葉期同工酶共顯現(xiàn)出15條酶帶（草地早熟禾9條，青海扁莖早熟禾6條），Rf值變動在0.01～0.60之間，酶帶出現(xiàn)的頻率差異不是很大，說明試材間遺傳相似程度較高。

3 討論

1）從酶譜特征可以看出，草地早熟禾與青海扁莖早熟禾在幼葉期的酶譜譜帶數(shù)分別為8條、9條，其中8條為共同的譜帶；在旗葉期的譜帶數(shù)分別為9條、6條，其中6條為共有帶，說明草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的親緣關系較近。

2）草地早熟禾與青海扁莖早熟禾在幼葉期及旗葉期POD同工酶酶譜的譜帶數(shù)、Rf值和表達量都存在不同程度的差異。最明顯的是扁莖早熟禾在幼葉期比草地早熟禾多了1條譜帶C1，C1是青海扁莖早熟禾幼葉的特征譜帶，而草地早熟禾卻沒有這條譜帶。且D2區(qū)酶的表達量也明顯高于草地早熟禾的表達量。再次，草地早熟禾在B區(qū)的表達量高于青海扁莖早熟禾。

在旗葉期，最明顯的是草地早熟禾在D區(qū)有3條染色較淺酶帶，這是草地早熟禾在旗葉期獨有的譜帶，而青海扁莖早熟禾卻沒有這3條譜帶。其次在B區(qū)和C區(qū)酶的表達量都有較為明顯的差異。其中C區(qū)草地早熟禾POD同工酶的表達量明顯高于青海扁莖早熟禾的表達量。

從草地早熟禾與青海扁莖早熟禾所特有的酶譜特征可以證明供試的2個材料具有獨立的遺傳關系，二者之間有一定的遺傳分化。

3）謝可軍等[10]、柴琦等[11]采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術，對多種早熟禾屬植物進行了遺傳多樣性分析，根據(jù)電泳結果計算出酶帶的相對遷移率Rf值，繪制出酶譜圖，探索將同工酶電泳技術應用于早熟禾屬植物種質鑒定以及種間遺傳距離分析的可能性。

4 結論

采用POD同工酶對同屬不同物種及種內不同品種進行分析，不僅能較為客觀地反映物種及品種間的遺傳差異和它們的親緣關系，而且利用其進行物種的輔助鑒定，是一種較為方便、有效的手段。

本研究中草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的POD同工酶譜類型十分豐富， 在同一發(fā)育時期，POD同工酶酶譜和活性強弱是穩(wěn)定的，能反映草地早熟禾與青海扁莖早熟禾的遺傳特性。而在植株發(fā)育的不同時期，POD同工酶酶譜的分布、活性及表達量均有所不同。兩種植物在不同時期各自都有共同帶和特異帶。草地早熟禾與青海扁莖早熟禾在酶帶數(shù)量、位點及分布格局上有一定的相似性，共有帶數(shù)量較多，說明兩種植物間存在著親緣關系。同時，兩種供試材料的酶帶數(shù)量、帶級、位點及活性強度等表現(xiàn)出一定差異，各自具有特征譜帶，且所具有的共有帶的帶級各不相同，酶的含量、活性強度也不盡相同，利用這些酶譜特征找出供試材料間的細微差異是可行的，以此證明供試的2個早熟禾屬植物材料具有獨立的遺傳關系，兩者之間有一定的遺傳分化，是兩者進行生化水平鑒定的有利指標。另外，兩種試材在不同的生育階段其同工酶酶譜表征也不相同，說明同工酶具有階段特異性、組織特異性和生理特異性。利用POD同工酶分析可區(qū)分供試材料間的細微差異，是對形態(tài)學分類的重要補充和延伸，可為正確選擇雜交親本和雜種后代的鑒定提供依據(jù)。

參考文獻：

[1] 曉 紅，劉及東.草地早熟禾宜牧性狀的研究[J].內蒙古農(nóng)牧學報，1998，19（1）：118-120.

[2] 趙桂琴.早熟禾育種的研究進展與現(xiàn)狀[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2000，35（2）：119-126.

[3] 張瑞麟，趙 清，范 敏，等.我國草地早熟禾的研究進展[J].草業(yè)科學，2005，22（7）：67-69.

[4] 劉迎春，E·林柏克，馬玉壽.青海省果洛地區(qū)牧草引種試驗報告[J].中國草地，2002，24（2）：20-24.

[5] 馬玉壽，郎百寧，王啟基. “黑土灘”退化草地研究工作的回顧與展望[J].草業(yè)科學，1999，16（2）：5-9.

[6] 文金花，馬玉壽，施建軍，等.利用草地早熟禾改建江河源區(qū)“黑土型”退化草地的研究[J].草原與草坪，2006（2）：41-44.

[7] 劉文輝，周青平，顏紅波.青海扁莖早熟禾種子生長生理特性研究[J].草業(yè)科學，2007，24（5）：69-73.

[8] 周青平，顏紅波，韓志林，等.高原根莖型優(yōu)質草種“青海扁莖早熟禾”的馴化選育[J].草地學報，2008，16（4）：329-335.

[9] 孫 群.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[10] 謝可軍，李陽春，吳天德.10種早熟禾屬植物的過氧化物酶同工酶分析[J].中國草地，2003，25（2）：30-33.

[11] 柴 琦，張建全，左 昆，等.26個草地早熟禾品種同工酶的譜帶特征[J].草業(yè)科學，2008，25（1）：31-37.