苦玄參褐斑病病原鑒定及致病因素分析

摘要：為明確近年來引起廣西梧州地區(qū)苦玄參（Picria felterrae Lour.）褐斑病的病原菌種類及致病因素，依據(jù)柯赫氏法則進行了致病性測定和病原菌驗證，通過形態(tài)學觀察、rDNA-ITS序列分析確定病原菌；通過對不同光照條件下病情調(diào)查，分析光照對該病害發(fā)生的影響。結(jié)果表明，病原菌形態(tài)特征與[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]一致，其rDNA-ITS序列與GenBank中[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]相似性達99%；強光利于病原菌菌絲生長、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)?？梢娢嘀莸貐^(qū)苦玄參褐斑病病原菌為蔥鏈格菌[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]；光照是誘發(fā)苦玄參褐斑病的主要致病因素。

關(guān)鍵詞：苦玄參；褐斑病；病原鑒定； 致病因素

中圖分類號：S482.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3836-03

苦玄參（Picria felterrae Lour.）又名苦草、魚膽草、四環(huán)素草、蛇總管，為玄參科苦玄參屬植物，以全草入藥，是《中華人民共和國藥典》收載品種[1]，主要分布于廣西、廣東及云南等地，在廣西民間作藥用已有200多年的歷史[2]。

苦玄參作為廣西大宗、道地藥材，是廣西梧州制藥（集團）股份有限公司生產(chǎn)的婦炎凈膠囊的主要原料藥材，也是廣西多家制藥企業(yè)生產(chǎn)的炎腫化毒片、炎見寧片、萬通炎康片、維威消炎靈等多種中成藥的原料藥材[3]。隨著醫(yī)藥市場需求的逐年增加，苦玄參在廣西梧州地區(qū)廣泛栽培。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來苦玄參褐斑病在梧州各栽培區(qū)普遍發(fā)生，造成葉斑、葉片枯黃，嚴重者葉片全部卷縮，植株枯死。國內(nèi)外關(guān)于苦玄參病害的研究尚未見報道，褐斑病為首次報道的苦玄參病害。明確苦玄參褐斑病病原菌對于該病害的預(yù)防與控制具有重要意義。

環(huán)境因素對病害的發(fā)生流行起著重要作用，就光照與苦玄參褐斑病的關(guān)系進行探討，可以闡明光照在該病害的發(fā)生中的作用，以指導生產(chǎn)。

1 材料和方法

1.1 病菌采樣與分離、純化

苦玄參褐斑病典型病葉采自廣西梧州市嶺角鎮(zhèn)武烈村。病原菌的分離及純化參照文獻[4]。采集的病葉用清水洗凈，剪取病葉組織（邊長4～5 mm的正方形），用75%的乙醇消毒2～3 s，0.1%氯化汞消毒2 min，無菌水沖洗3遍，置于滅菌濾紙上吸干水，將病葉組織接種在馬鈴薯葡萄糖（PDA）瓊脂培養(yǎng)基上，26 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，對分離物歸類、編號。純化培養(yǎng)采用單孢分離法純化產(chǎn)孢真菌，采用多次挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)皿純化不產(chǎn)孢真菌，純化后的真菌轉(zhuǎn)管保存。

1.2 致病性測定[4]

將純化菌株接種至PDA瓊脂培養(yǎng)基，在28 ℃、相對濕度65%霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用打孔器制備直徑9 mm的菌餅。用無菌接種針在健康的離體苦玄參葉片上刺成面積約為1 cm2的傷口，用接種鏟將菌餅接至傷口，保濕培養(yǎng)3～4 d，觀察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病葉片病菌進行再分離，顯微鏡下觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。以接種PDA培養(yǎng)基作為對照，在室溫（20～25 ℃）下保濕培養(yǎng)5 d，記錄發(fā)病情況。

1.3 形態(tài)學鑒定

將致病菌株移至PDA平板上28 ℃下培養(yǎng)，玻片培養(yǎng)法觀察，記載病原菌的形態(tài)特征，以病原菌菌落形態(tài)、病害癥狀為依據(jù)鑒定病原菌種屬[4]。

1.4 核糖體rDNA-ITS序列分析

采用SDS法提取病原菌株的基因組DNA[5]。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）擴增該菌的rDNA-ITS序列。擴增產(chǎn)物的純化和測序委托北京諾賽基因組研究中心有限公司完成，將得到的序列在GenBank中進行同源性比較[6]。

1.5 光照對病害的影響

選擇除光照條件不同外，土壤、栽培管理等其他條件均一致的栽培地，采用LI-1400型便攜式光量子輻射計分別測定各栽培地的光照強度。對不同光照條件下的苦玄參進行發(fā)病情況調(diào)查，每地塊隨機調(diào)查5個點，每個點查20株，每株調(diào)查10張葉片，調(diào)查葉片病級情況（分級標準見表1），統(tǒng)計發(fā)病株數(shù)及病情指數(shù)[7]。

病情指數(shù)=（各級病級代表值×該病級病葉數(shù)）/（調(diào)查葉片數(shù)×發(fā)病最重級代表值）×100。

2 結(jié)果和分析

2.1 病害癥狀

苦玄參褐斑病在廣西梧州始于5月初，苗期可見癥狀發(fā)生，但為害不嚴重。6月下旬至8月是苦玄參的田間生長旺期，也是病害發(fā)生高峰期。多從靠近心葉的2～3片葉片開始發(fā)病，受害葉片初期病部呈水漬狀淡黃小點，病斑不斷擴大，形成不規(guī)則黃褐色斑塊，大小為0.2～0.4 cm×0.5～0.8 cm，病健交界處為紫褐色（圖1a）。天氣或環(huán)境潮濕時，病葉呈水漬狀；天氣或環(huán)境干燥時病斑穿孔。后期病斑連片，病葉卷縮，呈火燒狀。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌分離、純化 患褐斑病苦玄參組織26 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d后長出菌落，共分離到5株真菌菌株。

2.2.2 致病性測定 將分離所得的5株菌株室內(nèi)接種至健康的離體苦玄參葉片上保濕培養(yǎng)5 d，僅K-1-2菌株接種的發(fā)?。▓D1a），其他未發(fā)病。發(fā)病葉片表現(xiàn)出明顯的褐色水漬狀斑點，對病葉進行病菌再分離接種，獲得與原分離菌株一致的菌株。根據(jù)柯赫氏法則，確定試驗中分離的K-1-2菌株為苦玄參褐斑病的病原菌。

2.2.3 病原菌的形態(tài)特征 菌株K-1-2在PDA瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，有同心輪紋（圖1b），初期菌絲白色，6～7 d后呈灰白色，菌絲顏色逐漸加深，從平皿背面觀察到培養(yǎng)基的顏色逐漸加深至黑色。顯微鏡下觀察，分生孢子梗單生或5～10個簇生，淡褐色有隔膜2～3個，不分枝或不規(guī)則稀疏分枝，大小為30～100 μm×4～9 μm，其上著生分生孢子。分生孢子褐色，常單生，直或略彎，倒棍棒狀，或孢子本體橢圓形，至喙部（嘴胞）漸細，分生孢子具縱橫隔膜5～15個，縱隔膜1～6個（圖1c），大小為6～130 μm×15～20 μm，最長的可達300 μm，喙部直或彎曲，具隔膜0～7個，大小45～432 μm×2～4 μm。根據(jù)病原菌上述形態(tài)特征，參照文獻[8，9]，發(fā)現(xiàn)符合半知菌亞門鏈格孢屬蔥鏈格孢[Alternaria porri（ELL.）Ciferri]的菌落和孢子特征，初步鑒定病原菌為蔥鏈格孢。

2.2.4 病原菌核糖體DNA-ITS序列分析 采用通用引物ITS1/ITS4對苦玄參褐斑病病原菌菌株的rDNA-ITS序列進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1個大小約為500 bp的片段；經(jīng)序列測定確定該片段全長451 bp（圖2），1～51 bp為部分18 S rDNA，52～201 bp為ITS1，202～351 bp為5.8 S rDNA，352～401 bp為ITS4，402～451 bp為部分5.8 S rDNA。將上述測序結(jié)果在GenBank進行同源性分析，得知該病原菌株與Alternaria porri（ELL.）Ciferri的同源性達99%。結(jié)合形態(tài)鑒定，確定該病原菌為Alternaria porri（ELL.）Ciferri。

2.3 光照強度對病害發(fā)生的影響

對不同光照條件下的苦玄參發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果（表2）表明，苦玄參褐斑病隨著光照強度的增加而加重。觀察發(fā)現(xiàn)，全光照環(huán)境中種植的苦玄參，葉片病斑多、皺縮，植株較細小，分蘗不旺盛，生長后期不封行；設(shè)有一層遮陽網(wǎng)栽培的苦玄參，與不遮陽相比，發(fā)病率及病情指數(shù)均明顯降低；在蔭蔽的竹林邊，苦玄參植株生長旺盛，莖稈粗壯，葉片厚且濃綠，生長后期封行。說明強光利于病原菌菌絲生長、孢子產(chǎn)生及萌發(fā)，光照過強是誘發(fā)苦玄參褐斑病發(fā)生的重要因素，光照強、溫度高、濕度大極易造成褐斑病流行。

3 小結(jié)與討論

鏈格孢屬（Alternaria）真菌能侵染多種植物引起葉斑病，是植物葉部病害常見病原菌[10，11]。本研究在傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的基礎(chǔ)上，通過對苦玄參褐斑病病原菌的rDNA-ITS進行分析比對，從分子生物學水平上進一步明確了蔥鏈格孢為苦玄參褐斑病的病原真菌?？嘈⑹鞘[鏈格孢的新記錄寄主。

苦玄參生長在熱帶、亞熱帶丘陵、山谷的雨林或季節(jié)性雨林下，是一種喜溫暖濕潤耐陰的植物[12]。近年來大面積擴植，很多直接種植在水田改的旱地里，日照時數(shù)及強度均大大增加，田間苦玄參褐斑病發(fā)生嚴重。本研究結(jié)果表明，光照是該病害的重要致病因子，建議在選擇栽培地的時候重視遮陰條件，最好選擇在自然蔭蔽環(huán)境下種植（如林下），不僅滿足遮陰條件而且較為陰涼、通透，不利于病害的流行。

參考文獻：

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