產(chǎn)β—甘露聚糖酶菌株育種及培養(yǎng)基優(yōu)化

摘要：利用實驗室篩選保藏最高酶活為10.7 U/mL的白腐真菌作為出發(fā)菌株，進行紫外誘變育種及培養(yǎng)基優(yōu)化，以期提高菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶能力。結(jié)果表明，紫外誘變條件為孢子懸液濃度106～107個/mL，誘變時間10 min，此條件下的孢子致死率達78%，獲得了13株正向突變株，經(jīng)6代遺傳穩(wěn)定性試驗證明UV-2突變株酶活最高，遺傳穩(wěn)定性最強，比出發(fā)菌株酶活提高了2.075倍。通過單因素試驗確定了該突變株的最佳碳源、氮源分別為魔芋粉和硝酸銨，對酶活影響較大的無機鹽為磷酸二氫鉀。通過正交試驗，確定了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基為魔芋粉4.0 g/L、NH4NO3 5.0 g/L、KH2PO4 5.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L，在此條件下測得甘露聚糖酶最大酶活為46.17 U/mL，比優(yōu)化前提高了40.3%。

關(guān)鍵詞：β-甘露聚糖酶；白腐真菌；誘變；正交試驗；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號：Q933；Q93-335 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3820-04

在世界能源日益短缺的形勢下，植物纖維作為可再生有機資源越來越受到重視，其主要成分為纖維素、木質(zhì)素和半纖維素。半纖維素約占植物干重的35%，含量是僅次于纖維素的雜聚物生物資源，其中最具代表性的兩種半纖維素是木聚糖和甘露聚糖[1]。β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）可降解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的β-1，4-D-吡喃甘露糖主鏈[2]。微生物來源的β-甘露聚糖酶具有活力高、成本低、來源穩(wěn)定、提取方便等明顯優(yōu)點[3]，近年來隨著人們對自然界中半纖維素資源的開發(fā)和對甘露低聚糖保健價值的發(fā)現(xiàn)，微生物甘露聚糖酶再次成為研究熱點[4-6]。不同來源的β-甘露聚糖酶對不同底物的作用程度及其水解產(chǎn)物是不相同的[7-9]。甘露聚糖酶具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價值，可用于飼料、食品、輕工和石油行業(yè)等[4，6-9]。

試驗利用江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室保藏的白腐真菌，采用紫外誘變的方法使出發(fā)菌株酶活提高，并采用正交試驗進行培養(yǎng)基的優(yōu)化以進一步提高酶活，以期為甘露聚糖酶的進一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：白腐真菌，由江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室篩選保藏。

儀器：LDZX型自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；BCM-1000超凈工作臺（上海和呈儀器制造有限公司）；QYC-211恒溫搖床（上海福瑪實驗設(shè)備有限公司）；721型分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基及配制方法

1）固體斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

2）篩選培養(yǎng)基：魔芋粉5.0 g，NaCl 2.0 g，瓊脂20.0 g，加去離子水至1 000 mL，pH 6.0[10]。

3）發(fā)酵產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基：魔芋粉5.0 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO4 1.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，加去離子水至1 000 mL，pH 6.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)條件 種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶培養(yǎng)基均在250 mL三角瓶中裝液100 mL，搖瓶中加入10顆玻璃珠。搖瓶培養(yǎng)條件均為26 ℃、150 r/min。種子培養(yǎng)時間為24 h，接種量為10%。

1.3.2 β-甘露聚糖酶酶活測定方法

1）甘露糖標準曲線的繪制。取0.01 mol甘露糖，用0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）溶解定容至100 mL，制成濃度為100 μmol/mL的甘露糖儲備液。分別移取100 μmol/mL的甘露糖儲備液至100 mL容量瓶中，用去離子水配制成濃度分別為1、2、3、4、5、6 μmol/mL的甘露糖溶液。分別在不同試管中各移取1.00 mL上述6種不同濃度的甘露糖溶液及1.00 mL緩沖溶液，再分別添加DNS 2.00 mL，沸水浴5 min，取出冷卻至室溫，加去離子水10.00 mL，在540 nm處測定吸光度[11，12]。

2）粗酶液的制備。取發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

3）甘露聚糖酶活力的測定。將魔芋粉溶于pH 6的磷酸鈉緩沖液中配制20 g/L的溶液作為底物，在0.9 mL底物中加入0.1 mL適當稀釋的粗酶液，于50 ℃水浴反應(yīng)10 min[2]，加入DNS試劑2.0 mL，沸水浴5 min顯色，立即以流動水冷卻至室溫，加去離子水定容至10.00 mL，以空白液調(diào)零，在540 nm處測定吸光度。每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需酶量定義為1個酶活力單位（U）[11，12]。計算公式如下：

U=N×G/（L×T）

式中，N為酶液稀釋倍數(shù)，G為酶解液中還原糖含量，L為加酶量，T為酶解時間。

1.3.3 紫外誘變方法 取培養(yǎng)3 d長滿成熟孢子的斜面，用無菌生理鹽水將孢子洗下，制成孢子懸液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，將孢子懸液濃度調(diào)至106～107個/mL。取10 mL孢子懸液置于培養(yǎng)皿中，打開磁力攪拌器，用15 W紫外燈于30 cm距離處分別照射2、4、6、8、10、12、14 min后，分別取0.2 mL誘變后的孢子懸液梯度稀釋涂平板，以未照射孢子為對照，26 ℃恒溫暗培養(yǎng)48 h后計單菌落數(shù)，繪制致死曲線以確定最適紫外誘變條件。在每個平板上加入一層剛果紅溶液，靜置10 min，將染色液倒掉后測定菌株產(chǎn)生的水解圈大小，選取水解圈與菌落直徑比較大的作為復篩用菌株。將初篩菌株按上述培養(yǎng)條件測定酶活，選擇正向突變菌株[13]。

1.3.4 正交試驗 選擇影響酶活較大的3個主要因素碳源、氮源和無機鹽，按L9（34）設(shè)計正交試驗優(yōu)化影響產(chǎn)酶的因素條件，正交試驗因素與水平如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變結(jié)果

孢子懸液隨誘變時間致死率變化曲線如圖1所示。由圖1可知，隨著誘變時間延長，致死率增加，當誘變處理時間為10 min時，致死率達到78%，將10 min作為紫外誘變處理的最佳時間。

2.2 正向突變菌株的篩選結(jié)果

根據(jù)篩選培養(yǎng)基染色后的水解圈與菌落直徑比，選擇比值較大的菌株進行復篩搖瓶實驗，按上述方法制備粗酶液，測定酶活，獲得正向突變株13株，其中酶活最大的為UV-2，對其進行連續(xù)6代傳代，檢驗其遺傳穩(wěn)定性。由試驗結(jié)果（表2）可知，經(jīng)6代遺傳穩(wěn)定性試驗證明UV-2正向突變株穩(wěn)定性較好，與出發(fā)菌株最高酶活10.7 U/mL相比，酶活提高了2.075倍。

2.3 培養(yǎng)基成分對酶活的影響

2.3.1 碳源的影響 碳源是培養(yǎng)基中最為重要的組分，它為菌體的生長和代謝提供物質(zhì)基礎(chǔ)，所以不同的碳源會對菌體產(chǎn)酶產(chǎn)生不同的作用效果。采用UV-2菌株進行試驗，選擇葡萄糖、甘露糖、可溶性淀粉、麩皮和魔芋粉作為碳源，其添加量同發(fā)酵產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基，其他物質(zhì)及添加量完全同液體培養(yǎng)基， 結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，以魔芋粉作為碳源時UV-2的酶活最高，達33.5 U/mL。這可能是由于β-甘露聚糖酶是誘導酶，產(chǎn)酶需要甘露糖作為底物來誘導產(chǎn)生，故選擇魔芋粉作為UV-2發(fā)酵產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基的碳源。

2.3.2 氮源的影響 氮源作為發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的一個主要成分，對菌體產(chǎn)酶發(fā)揮著重要作用。采用UV-2菌株進行試驗，以魔芋粉作為碳源，選擇蛋白胨、硝酸銨、酵母膏、豆粕及尿素作為氮源，其添加量同發(fā)酵產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基，其他物質(zhì)及添加量完全同液體培養(yǎng)基， 結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，以硝酸銨作為氮源菌株產(chǎn)酶能力最強，酶活最高，采用尿素時所產(chǎn)酶的活力亦比其他氮源要高。這可能是因為無機氮源比有機氮源更利于菌株產(chǎn)酶，故選擇硝酸銨作為UV-2發(fā)酵產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基的氮源。

2.3.3 無機鹽的影響 采用上述最佳碳源和最佳氮源進行試驗，研究KH2PO4、NaCl和MgSO4·7H2O對產(chǎn)酶的影響，試驗中僅改變一種無機鹽的濃度，其他濃度均同發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，NaCl和MgSO4·7H2O對產(chǎn)酶影響不大，而KH2PO4對產(chǎn)酶影響較大，因此選擇KH2PO4作為正交試驗因素。

2.3.4 正交試驗結(jié)果 在優(yōu)化好碳源和氮源種類的基礎(chǔ)上，結(jié)合無機鹽對產(chǎn)酶效果的影響，采用L9（34）進行正交試驗，優(yōu)化UV-2培養(yǎng)條件，結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，對酶活影響各因素的大小順序為B>C>A，即因素2硝酸銨的極差最大，說明其對結(jié)果的影響最大；x1，x2，x3反映了因素各水平對試驗結(jié)果的影響，因而最大的x值對應(yīng)了最好的水平，由此可知產(chǎn)酶培養(yǎng)基較適宜配比為A1B2C3，即魔芋粉4.0 g/L、硝酸銨5.0 g/L，磷酸二氫鉀5.0 g/L。在此條件下進行驗證試驗，測得甘露聚糖酶活為46.17 U/mL，比優(yōu)化前提高了40.3%。

3 結(jié)論

以江蘇省生物質(zhì)轉(zhuǎn)化與過程集成工程實驗室篩選保藏的白腐真菌為出發(fā)菌株，其最高酶活為10.7 U/mL，采用紫外誘變法提高菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶能力，結(jié)果表明，當孢子懸液濃度為106～107個/mL，紫外誘變時間為10 min時，孢子致死率達78%。在此條件下進行紫外誘變，獲得了13株正向突變株，其中以UV-2菌株的產(chǎn)酶能力最強，經(jīng)6代遺傳穩(wěn)定性試驗得出UV-2突變株遺傳穩(wěn)定性較好，與出發(fā)菌株最高酶活相比，該菌株的酶活提高了2.075倍。通過單因素試驗確定了該突變株的最佳碳源為魔芋粉，最佳氮源為硝酸銨，影響較大的無機鹽為磷酸二氫鉀，在此基礎(chǔ)上進行正交試驗，獲得最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分為魔芋粉4.0 g/L，硝酸銨5.0 g/L，磷酸二氫鉀5.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，在此條件下測得甘露聚糖酶最大酶活為46.17 U/mL，比優(yōu)化前提高了40.3%。通過紫外誘變和培養(yǎng)條件優(yōu)化，誘變株產(chǎn)β-甘露聚糖酶能力提高了3.31倍。

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