殼聚糖酶的分離純化及性質研究

摘要：利用芽孢桿菌（Bacillus sp.）Yg菌株發(fā)酵產殼聚糖酶，采用分段醇析法分離純化發(fā)酵產物，通過不連續(xù)SDS-PAGE法測定殼聚糖酶相對分子質量。結果表明，發(fā)酵產物先用體積分數40%的乙醇初步醇析，離心去除沉淀，而后加乙醇至體積分數為60%再次醇析，所得沉淀冷凍干燥即為殼聚糖酶，所得酶的回收率和純度均較高。所得殼聚糖酶的相對分子質量約為41.7 ku，最適反應溫度為45 ℃，最佳反應pH為5.5。該酶在4 ℃條件下保存穩(wěn)定性較好，在65 ℃及以上溫度下短時間內即全部失活。

關鍵詞：殼聚糖酶；發(fā)酵；純化；酶活力；穩(wěn)定性

中圖分類號：TQ925+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）15-3647-03

殼寡糖為殼聚糖降解產物，具有水溶性好、易吸收、無毒、無變異性的特性，具有很高的生物活性，應用領域廣泛[1，2]。殼聚糖酶是專一性水解殼聚糖生成殼寡糖的酶，殼聚糖酶水解法是目前制備殼寡糖的最佳方法[3]。我國目前還沒有自主研發(fā)的殼聚糖酶制品，殼聚糖酶的研究與開發(fā)利用已成為我國殼寡糖生產和應用的關鍵與瓶頸。本研究利用前期自行分離獲得的產殼聚糖酶芽孢桿菌（Bacillus sp.）Yg菌株發(fā)酵產殼聚糖酶，對產物進行分離、純化，并對殼聚糖酶的相關性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌Yg菌株由廊坊師范學院生命科學學院提供。殼聚糖（脫乙酰度>80%，國藥集團化學試劑有限公司）。Marker：MBP-[3-galactosidase（175 ku）、MBP-CBD（62 ku）、Triosephosphate isomerase（32.5 ku）、β-Lactoglobulin A（25 ku）。丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇、溴酚藍、過硫酸銨、考馬斯亮藍R-250、無水乙醇、冰醋酸均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制備及活力測定 Yg菌株接種PDA液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h制備種子液，按5%的接種量接于產酶培養(yǎng)基（NaCl 5 g/L、KCl 5 g/L、MgSO4·7H2O 5 g/L、K2HPO4 0.75 g/L、FeSO4 0.01 g/L、蛋白胨 8.5 g/L、牛肉膏 0.25 g/L、殼聚糖 10 g/L，pH 7.5～8.0）中，30 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液5 000 r/min、4 ℃離心20 min得粗酶液。45 ℃預熱后將粗酶液按10%的體積分數加入30 g/L的殼聚糖膠體溶液中，45 ℃、180 r/min條件下反應，定時取樣，1 mol/L NaOH 調節(jié)pH 8.0，沸水浴20 min終止反應，離心取沉淀，烘干稱重，計算酶活力。以每分鐘催化1 μg不溶性殼聚糖轉化為水溶性低聚糖所需要的酶量作為一個酶活力單位（U）[4]。

1.2.2 殼聚糖酶的分離及活力測定 發(fā)酵液中加入無水乙醇至乙醇體積分數分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%，4 ℃靜置過夜，5 000 r/min、4 ℃離心10 min[5]，分別測定上清液與沉淀中的殼聚糖酶活力，確定分離殼聚糖酶的乙醇濃度。在最適條件下對殼聚糖酶進行醇析分離，真空冷凍干燥制得殼聚糖酶粉。殼聚糖酶粉加蒸餾水溶解，按“1.2.1”方法測定其活力。

1.2.3 殼聚糖酶相對分子質量的測定 采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳[6]測定殼聚糖酶相對分子質量。制膠、上樣后10 mA電泳分離，指示劑到達濃縮膠與分離膠分界線時調電流為20 mA，電泳后去除濃縮膠、染色、脫色。依據樣品與標準蛋白樣品的相對遷移距離計算殼聚糖酶的相對分子質量。

1.2.4 殼聚糖酶反應條件研究[7] 分別于25、35、45、 55、65 ℃條件下測定殼聚糖酶活力，確定該酶的最適反應溫度；分別于pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0條件下測定殼聚糖酶活力，確定該酶的最適反應pH。

1.2.5 殼聚糖酶熱穩(wěn)定性研究[8] 將殼聚糖酶分別置于4 ℃、25 ℃（室溫）、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃條件下保存一定時間后測定酶活力。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖酶醇析條件的選擇

經測定，原酶液中殼聚糖酶活力為1 895 U/mL。不同體積分數的乙醇醇析后，分別測定上清液與沉淀中殼聚糖酶的酶活力，并換算為原酶液每毫升所得上清液及沉淀的酶活力，測定結果見表1。從表1可以看出，隨著乙醇體積分數的升高，上清液中酶活力逐漸降低，當乙醇體積分數高于50%時，上清液中殘余酶活為0；而沉淀中酶活力隨乙醇體積分數的升高先呈升高趨勢，乙醇體積分數超過60%時，沉淀中酶活力隨乙醇體積分數的升高有所降低。綜合判斷，殼聚糖酶最佳醇析條件確定為先用體積分數40%的乙醇初步醇析后離心去除沉淀，而后加乙醇至體積分數為60%再次醇析，取沉淀冷凍干燥后即得殼聚糖酶粉。經測定此種分離方法所得殼聚糖酶酶活力的回收率達81.9%。

2.2 殼聚糖酶的相對分子質量測定結果

經不連續(xù)SDS-PAGE法測定殼聚糖酶相對分子質量結果見圖1。從圖1可以看出，純化后的殼聚糖酶樣品經不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離得到一個條帶，說明Yg菌株所產殼聚糖酶為單一酶組分，且通過醇析法可分離純化殼聚糖酶達到電泳純。通過測量相對遷移距離，計算得出殼聚糖酶的相對分子質量約為41.7 ku。

2.3 殼聚糖酶的最適反應條件

對純化后殼聚糖酶粉在不同反應溫度及pH下的酶活力進行測定，結果見圖2和圖3。由圖2和圖3可知，隨著反應溫度和pH的升高，殼聚糖酶的活力均呈先升高后降低的變化趨勢，在溫度45 ℃、pH 5.5時酶活力最高。

2.4 殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性

所得殼聚糖酶初始酶活力測定為4 596 U/mg，在不同保存條件下殼聚糖酶活力的測定結果見表2。從表2可以看出，殼聚糖酶活力隨保存時間的延長而降低，保存溫度越高酶活力下降速度越快。其中在4 ℃下保存90 d時酶活力仍高達3 984 U/mg，為保存初期的84.7%；而在25 ℃（室溫）下保存7 d后酶活力約為初始保存時的81.6%，30 d時酶活力僅為117 U/mg，90 d時酶活力已完全喪失；在較高溫度（65、75 ℃）下保存，酶在短時間內即完全失活。可見試驗分離得到的殼聚糖酶適合在低溫條件下保存。

3 小結與討論

利用Yg菌株發(fā)酵產殼聚糖酶，采用分段醇析法分離純化發(fā)酵產物，通過不連續(xù)SDS-PAGE法測得殼聚糖酶相對分子質量約為41.7 ku，所得殼聚糖酶最適反應溫度為45 ℃，最佳反應pH為5.5。該酶在4 ℃條件下保存穩(wěn)定性較好，在65 ℃及以上溫度下短時間內即全部失活。

由醇析過程中酶活力的變化情況可以看出，醇析可造成殼聚糖酶活力的少量損失。殼聚糖酶粉的最適反應溫度和pH與原酶液相同，說明醇析和冷凍干燥對殼聚糖酶性質的影響不大。

參考文獻：

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[3] 屠 潔，張榮華.殼聚糖酶的研究進展與應用現(xiàn)狀[J]. 江蘇農業(yè)科學，2009（3）：403-406.

[4] 袁建平，李 潔，王利敏. 高產殼聚糖酶菌株選育[J].廊坊師范學院學報（自然科學版），2009，9（1）：66-67.

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