紅景天苷體外抗EV71病毒的作用

摘要：應(yīng)用MTT法研究紅景天苷對(duì)Vero細(xì)胞的毒性以及對(duì)腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）的抑制作用，通過吸附試驗(yàn)和穿入試驗(yàn)觀察紅景天苷是否對(duì)EV71的吸附和穿入具有抑制作用。結(jié)果表明，紅景天苷的細(xì)胞毒性低，半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）為4.25 mg/mL。藥物在病毒感染前加入（藥物預(yù)處理）、藥物和病毒同時(shí)加入及藥物在病毒感染后加入都能夠抑制病毒，以藥物預(yù)處理細(xì)胞抗病毒作用最好；紅景天苷能夠抑制病毒的吸附和穿入作用，對(duì)吸附作用抑制效果更強(qiáng)。表明紅景天苷能夠在體外抑制病毒對(duì)細(xì)胞的感染。

關(guān)鍵詞：紅景天苷；腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）；Vero細(xì)胞；體外抑制

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3605-04

腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬[1，2]。該病毒可感染T淋巴細(xì)胞、人血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，觸發(fā)受感染細(xì)胞凋亡[3-5]，引起人類手足口?。℉and，foot and mouth disease，HFMD），進(jìn)而引發(fā)腦炎（Encephalitis）、無菌性腦膜炎（Aseptic meningitis）和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹性疾?。≒oliomyelitis-like paralysis）等多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)病，致殘和致死率較高[6-8]，自1974年以來，已在全球多次暴發(fā)和流行[9]，目前尚無特效疫苗和藥物。

有研究表明，許多中藥及其活性成分能夠有效抑制EV71病毒[10-12]，所以，從傳統(tǒng)中藥中篩選抗EV71病毒藥物越來越得到重視。紅景天苷是從紅景天（Rhodiola rosea L）中提取的植物天然活性成分，具有抗衰老、抗癌、抗炎癥、肝癌保護(hù)和抗氧化作用等多種藥學(xué)特性[13-15]，對(duì)心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用[16]，具有改善心臟功能和保護(hù)心肌細(xì)胞作用[17]。已有研究表明紅景天苷對(duì)柯薩奇病毒具有顯著的抑制作用[18]，在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)紅景天苷在體外培養(yǎng)的細(xì)胞水平上抗EV71的作用進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和儀器

參試藥物紅景天苷（粉末狀，HPLC測定純度>98%）購自蘇州寶澤堂醫(yī)藥公司；動(dòng)物非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；EV71由河北省邯鄲市疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素均購自GIBCO；二甲基亞砜（DMSO）和溴化二甲噻唑二苯四氮唑（MTT）購自Sigma公司。CO2培養(yǎng)箱為Thermo產(chǎn)品；酶標(biāo)儀（ELX808IU）為BioTek產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡（TS100）為Nikon產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Vero 細(xì)胞培養(yǎng) 取DMEM培養(yǎng)基[添加1%雙抗（青霉素100 U/L，鏈霉素100 U/L）、10%胎牛血清，作為細(xì)胞生長液]4 mL于25 cm2培養(yǎng)瓶中，取凍存的Vero細(xì)胞株復(fù)蘇，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 紅景天苷對(duì)Vero細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 參照Nociari等[19]的方法，取上述Vero細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96孔板， 培養(yǎng)24 h，用細(xì)胞維持液（成分與細(xì)胞生長液相同，但含2%胎牛血清）稀釋紅景天苷使其終濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL，吸去原培養(yǎng)液，將各濃度紅景天苷分別加入各孔，以未加藥物組作為陰性對(duì)照，以無細(xì)胞的DMEM作為空白對(duì)照。每個(gè)濃度3復(fù)孔。在5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h，吸盡培養(yǎng)液， 每孔加入5 mg/mL的MTT 溶液10 μL，37 ℃下繼續(xù)孵育4 h，小心去除培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL， 輕輕振蕩以溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測定A490 nm值，細(xì)胞存活率= （試驗(yàn)組A490 nm-空白對(duì)照組A490 nm）/（陰性對(duì)照組A490 nm-空白對(duì)照組A490 nm）×100%。以細(xì)胞存活率為50%的藥物濃度作為半數(shù)細(xì)胞毒性劑量（CC50）。

1.2.3 紅景天苷對(duì)EV71的抑制作用 用“1.2.2”方法在96孔培養(yǎng)板中接種和培養(yǎng)單層細(xì)胞24 h，按照100 TCID50的量加入EV71，同時(shí)加入不同濃度（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 mg/mL，下同）紅景天苷，培養(yǎng)48 h。各孔加液量、培養(yǎng)條件、A490 nm測定方法（MTT法）和細(xì)胞存活率計(jì)算方法同“1.2.2”。

1.2.4 紅景天苷不同處理方式對(duì)EV71的抑制作用 用“1.2.2”方法在96孔培養(yǎng)板中接種和培養(yǎng)單層細(xì)胞24 h。分為A、B、C 3組，按照3種不同方式分別加藥。A組：病毒感染后加藥。按照100 TCID50的量加入EV71病毒，吸附2 h，吸去病毒液，加入不同濃度紅景天苷，培養(yǎng)48 h；B組：同時(shí)加藥物和病毒。不同濃度紅景天苷與100 TCID50 EV71混合，于37 ℃作用2 h，隨后加入96孔板培養(yǎng)48 h；C組：藥物預(yù)處理。用不同濃度紅景天苷分別預(yù)處理細(xì)胞2 h后，加入100 TCID50 EV71培養(yǎng)48 h。每個(gè)濃度3復(fù)孔。同時(shí)設(shè)有病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組A490 nm-病毒對(duì)照組A490 nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A490 nm-病毒對(duì)照組A490 nm）×100%。

1.2.5 紅景天苷對(duì)EV71吸附的抑制試驗(yàn) 用“1.2.2”方法在96孔培養(yǎng)板中接種和培養(yǎng)至其鋪滿單層細(xì)胞后，將96孔板置于4 ℃無菌條件下預(yù)冷1 h，按照100 TCID50的量加入EV71病毒，隨即加入不同濃度的紅景天苷，4 ℃下靜置孵育3 h，棄去全部培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次以去除尚未吸附的病毒，加入細(xì)胞生長培養(yǎng)基在孵箱中培養(yǎng)48 h后用MTT法測定其A490 nm。每個(gè)濃度3復(fù)孔。同時(shí)設(shè)有病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。細(xì)胞存活率的計(jì)算參照“1.2.4”。

1.2.6 紅景天苷對(duì)EV71穿入的抑制試驗(yàn) 參照“1.2.5”中的方法將鋪滿單層細(xì)胞的96孔板在4 ℃無菌條件下預(yù)冷1 h并加入EV71，繼續(xù)靜置3 h，隨即加入不同濃度的紅景天苷，置于37 ℃培養(yǎng)，使病毒最大限度穿入細(xì)胞。以每10 min為間隔，以pH 11的無菌PBS液沖洗細(xì)胞以終止病毒穿入，隨后立即加入pH 3的無菌PBS液沖洗細(xì)胞，之后加入細(xì)胞生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用MTT法測定A490 nm。每個(gè)濃度3復(fù)孔。同時(shí)設(shè)有病毒對(duì)照和細(xì)胞對(duì)照。細(xì)胞存活率的計(jì)算參照“1.2.4”。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用Microsoft Excel和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天苷細(xì)胞毒性

由圖1可見，紅景天苷參試最低濃度（1 mg/mL）時(shí)，細(xì)胞存活率接近100%；濃度提高時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)死亡；參試最高濃度（8 mg/mL）時(shí)細(xì)胞存活率仍接近50%，其CC50為4.25 mg/mL，約是常用廣譜抗病毒藥物利巴韋林（即病毒唑，CC50為244.76 μg/mL[20]）毒性的1/17。

2.2 紅景天苷對(duì)EV71的抑制作用

將不同濃度的紅景天苷與100 TCID50的EV71加入至細(xì)胞中培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察可見，試驗(yàn)組與病毒對(duì)照組相比，96孔板中出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的程度明顯降低。MTT法測孔的A490 nm值并計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖2。由圖2可見，紅景天苷可抑制EV71的感染作用，且具有濃度依賴性，但紅景天苷濃度達(dá)0.500 0 mg/mL后對(duì)病毒的抑制效果較穩(wěn)定。

2.3 紅景天苷不同處理方式對(duì)EV71的抑制作用

由表1可見，紅景天苷不同方式處理EV71病毒并培養(yǎng)48 h后，均可提高細(xì)胞存活率，對(duì)病毒產(chǎn)生一定的抑制作用，其中以C組（藥物預(yù)處理組）效果最為明顯。由圖3可見，未加入紅景天苷的一組出現(xiàn)強(qiáng)烈的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）（圖3B），而用0.500 0 mg/mL紅景天苷對(duì)EV71進(jìn)行不同處理后都能夠抑制CPE反應(yīng)，與表1結(jié)果一致。

2.4 紅景天苷對(duì)EV71吸附和穿入的抑制作用

由表2可見，紅景天苷可抑制EV71的吸附和穿入作用，且抑制吸附作用效果好于抑制穿入作用。紅景天苷對(duì)EV71吸附和穿入的抑制作用在其濃度小于0.500 0 mg/mL 時(shí)隨濃度的增加其抑制作用不斷增強(qiáng)，在大于這一濃度后反而有所下降。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)細(xì)胞的水平上，紅景天苷的半數(shù)細(xì)胞毒性劑量約是常用的廣譜抗病毒藥物病毒唑的1/17，說明紅景天苷的毒性很低，其安全性很高，因此選擇合適的濃度不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損害，同時(shí)說明其抗病毒作用并不依賴于其毒性。結(jié)合紅景天苷抑制病毒CPE的試驗(yàn)結(jié)果來看，紅景天苷在體外培養(yǎng)細(xì)胞水平上具有抑制EV71的致細(xì)胞病變作用，對(duì)病毒的抑制作用隨著藥物濃度的提高而提高。但通過比較紅景天苷不同處理方式對(duì)EV71的抑制作用，發(fā)現(xiàn)紅景天苷預(yù)處理細(xì)胞后具有較好的抗病毒效果，而在病毒吸附細(xì)胞后加入紅景天苷或紅景天苷直接與病毒液混合雖然也有一定的抗病毒作用，但其抑制作用不強(qiáng)，不能有效抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖。

盡管EV71的整個(gè)復(fù)制周期尚未完全研究清楚，但其關(guān)鍵步驟主要包括病毒吸附、脫衣殼、衣殼蛋白合成、病毒RNA復(fù)制和病毒組裝。這些關(guān)鍵的步驟都可成為抗病毒藥物研究的作用靶點(diǎn)?，F(xiàn)有的有效治療EV71藥物正積極地靶向這些過程[21]。本研究中對(duì)EV71吸附和穿入的抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示紅景天苷抑制病毒吸附作用更強(qiáng)。有研究表明益生菌通過競爭抑制結(jié)合到細(xì)胞表面的病毒受體上，可抑制病毒感染宿主細(xì)胞。Freitas等[22，23]發(fā)現(xiàn)益生菌Lactobacillus casei DN1 14001和多形擬桿菌產(chǎn)生一種可溶性化合物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞表面糖基化，保護(hù)上皮細(xì)胞免受輪狀病毒感染。推測紅景天苷可干擾病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而達(dá)到其抑制病毒感染的作用。

本試驗(yàn)初步明確了紅景天苷抗腸道病毒EV71的作用，紅景天苷可直接干擾病毒的吸附作用，機(jī)制可能是其與細(xì)胞表面受體結(jié)合產(chǎn)生競爭抑制從而抑制病毒感染，需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。高淑華等[24]研究還發(fā)現(xiàn)紅景天苷和苦參及黃芪等中藥聯(lián)合使用具有良好抗EV71效果，因而推測紅景天苷與其他藥物聯(lián)用可能具有更好的抗病毒效果。這將是下一步研究的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] 金 奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.606-613.

[2] MCMINN P C.An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance[J]. Fems Microbiol Rev，2002，26（1）： 91-107.

[3] LIANG C C， SUN M J， LEI H Y， et al. Human endothelial cell activation and apoptosis induced by enterovirus 71 infection[J]. Journal of Medical Virology，2004，74（4）：597-603.

[4] CHEN L C， SHYU H W， CHEN S H， et al. Enterovirus 71 infection induces Fas ligand expression and apoptosis of Jurkat cells[J]. Journal of Medical Virology，2006，78（6）：780-786.

[5] CHEN T C， LAI Y K， YU C K， et al. Enterovirus 71 triggering of neuronal apoptosis through activation of Abl-Cdk5 signaling[J]. Cellular Microbiology，2007，9（11）：2676-2688.

[6] CHANG L Y， LIN T Y， HSU K H， et al. Clinical features and risk factors of pulmonary oedema after enterovirus-71-related hand， foot and mouth disease[J]. Lancet，1999，354（9191）：1682-1686.

[7] ABUBAKAR S， CHEE H Y，AL-KOBAISI M F， et al. Identification of enterovirus 71 isolates from an outbreak of hand， foot and mouth disease （HFMD） with fatal cases of encephalomyelitis in Malaysia[J]. Virus Res，1999，61（1）：1-9.

[8] LIU C C， TSENG H W， WANG S M， et al. An outbreak of enterovirus 71 infection in Taiwan，1998： epidemiologic and clinical manifestations[J]. J Clin Virol，2000，17（1）：23-30.

[9] SCHMIDT N J， LENNETT E H， HO H H. An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of central nervous system[J]. Infect Dis，1974，129（3）：304-309.

[10] ZHU Q C， WANG Y， LIU Y P. Inhibition of enterovirus 71 replication by chrysosplenetin and penduletin[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences，2011，44（3）：392-398.

[11] CHANG C W， LEU Y L， HORNG J T. Daphne genkwa Sieb. et Zucc. Water-soluble extracts act on enterovirus 71 by inhibiting viral entry[J]. Viruses，2012，4（4）：539-556.

[12] LIU J N， YANG Y J， XU Y F， et al. Lycorine reduces mortality of human enterovirus 71-infected mice by inhibiting virus replication[J]. Virology Journal，2011，8（1）：483.

[13] IAREMII I N， GRIGOR'EVA N F. Hepatoprotective properties of liquid extract of Rhodiola rosea[J]. Eksp Klin Farmakol，2002，65（6）：57-59.

[14] KANUPRIYA PRASAD D， SAI RAM M， KUMAR R， et al. Cytoprotective and antioxidant activity of Rhodiola imbricata against tert-butyl hydroperoxide induced oxidative injury in U-937 human macrophages[J]. Mol Cell Biochem，2005， 275（1-2）：1-6.

[15] KUCINSKAITE A，BRIEDIS V，SAVICKAS A. Experimental analysis of therapeutic properties of Rhodiola rosea L. and its possible application in medicine[J]. Medicina（Kaunas），2004， 40（7）：614-619.

[16] 葉子聰，陳欽銘，金凱平，等.紅景天苷對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧后再給氧損傷的影響[J].中國藥理學(xué)報(bào)，1993，14（5）：424-426.

[17] SONG B， HUANG S B， LIU Q G， et al. Protective effect of Rhodiola sachalinensis A. Bor on myocardial ischemic reperfusion injury in rat[J]. Liaoning J Traditional Chin Med，2005，32： 256-258.

[18] WANG H B， DING Y Y， ZHOU J， et al . The in vitro and in vivo antiviral effects of salidroside from Rhodiola rosea L. against coxsackievirus B3[J]. Phytomedicine，2009，16（2-3）： 146-155.

[19] NOCIARI M M， SHALEV A， BENIAS P， et al. A novel one-step， highly sensitive fluorometric assay to evaluate cell-mediated cytotoxicity[J]. J Immunol Methods，1998，213（2）：157-167.

[20] CHOI H J， SONG J H， PARK K S， et al. In vitro anti-enterovirus 71 activity of gallic acid from Woodfordia fruticosa flowers[J]. Lett Appl Microbiol，2010，50（4）：438-440.

[21] CHEN T C， WENG K F， CHANG S C， et al. Development of antiviral agents for enteroviruses[J].J Antimicrob Chemother，2008，62（6）：1169-1173.

[22] FREITAS M， CAYUELA C， ANTOINE J M， et al. A heat labile soluble factor from bacteroides thetaiotaomicro VPI-5482 specifically increase the galactosylation pattern of HT29-MTX cells[J].Cell Microbiol，2001，3（5）：289-300.

[23] FREITAS M，TAVAN E， CAYUELA C， et al. Host-pathogens cross-talk. Indigenous bacteria and probiotics also play the game[J]. Biol Cell，2003，95（8）：503-506.

[24] 高淑華，宋曉東，孫 凱.芪紅膠囊對(duì)柯薩奇病毒黏附和穿入的抑制作用[J].中國藥物與臨床，2011，11（6）：627-629.